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抗体-蛋白A或-蛋白G微珠层析柱的制备

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蛋白A或蛋白G微珠-抗体层析柱是免疫亲和层析技术中最常用的微珠基质之一。此类层析柱容易制备,由于抗体分子是通过Fc段与微珠基质结合,抗原结合片段(Fab)可与抗原最大限度地发生作用。以下介绍的方法可用于蛋白质抗原的纯化,但类似的方案也适用于任何其他抗原。

抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力,可以选用蛋白A或蛋白G微珠。一般推荐将蛋白A用于与小鼠单抗IgG2a,IgG2b和IgG3亚类抗体交联,而将蛋白G用于IgGl类抗体。蛋白G用于与大鼠单抗的交联,对于各种多克隆抗体,蛋白A适用于家兔、人、猪、脉鼠、狗或猫的抗体,而蛋白G适用于小鼠、大鼠、绵羊、马、驴、牛或山羊的多克隆抗体。

一旦抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合后,再通过双功能结合剂将其交联。双功能结合剂的种类很多,但通常使用二甲基庚二酸酯(DMP),因其价廉而且易于操作。DMP的两种结合基团相同,都能与游离的氨基结合,由于其碳分子骨架的韧性大,大多数抗体-蛋白A或蛋白G组合在合适的距离内存在反应位点,故能有效地交联。偶然不能有效交联,可以使用带有不同长度碳原子空隙的其他交联剂。

准备工作

应用抗体亲和层析柱对各种蛋白质进行纯化时,最关键是在尽量温和的条件下将抗原从柱上洗脱下来,这样才能保持蛋白质的结构和/或功能不发生变化。连接抗原和抗体的结合键的类型和数量是决定了洗脱的难易程度。在制备层析柱用于大规模纯化之前,有必要对所有可利用的抗体进行测试,并从中选择适当的抗体来制备亲和层析柱。

~undefined将抗体结合到蛋白A或G微珠时,建议不要直接将抗体溶液流经蛋白A或G微珠层析柱,因为这样会使抗体形成一个浓度梯度,层析柱上面的浓度高,而下面的浓度低。为避免这种情况,应将抗体与微珠混合成泥浆状而使其结合。

试剂和特殊设备

1. 抗体;

2. 蛋白A或蛋白G微珠;

3 0.2mol/ml硼酸钠(pH9.0)和0.2mol/L乙醇胺(pH8.0)及PBS;

4. 二甲基庚二酸(DMP)和考马斯亮兰;

5. Laemmli 样品缓冲液:将4ml 10% SDS、2ml 甘油、1.2ml 1mol/L Tris(pH8.0)加入2.8ml蒸馏水中,加入0.01%溴酚兰作为指示剂,室温保存。使用时取上述液体5份,蒸馏水4份,1mol/L DTT 1份混合。

6. 摇床

操作步骤

1. 将抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合:一般使用的层析柱,每毫升湿的微珠大约可结合2mg的抗体。将抗体与蛋白A或G微珠混合,使成为一种稀薄的浆状。在10ml溶液总量中大约含lml微珠。轻轻振荡混匀,室温孵育1h。

如前所述,免疫亲和层析柱一般用单抗或经过亲和层析的多抗制备。也可以用不同来源的抗体,包括杂交瘤细胞培养上清、腹水、纯化的抗体溶液等。由于这些抗体能够与蛋白A或G微珠特异性结合,此步骤可以去除溶液中的其他物质。如果须知道与微珠结合抗体的准确量,在与微珠结合之前应对抗体进行纯化。

2. 用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠缓冲液(pH9.0)洗涤微珠2次,以3000′g离心5min,或10000′g离心30s。

3. 用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠,并取出相当于10ml微珠的混悬液。加足量的DMP(固体)至终浓度为20mmol/L。

~undefined如用DMP交联,应为pH 8.3以上。

4. 轻轻混匀,室温孵育30min,取出相当于10ml已交联的微珠。

5.用0.2mol/L乙醇胺洗涤微珠1次,以终止反应。然后用0.2mol/L乙醇胺重悬微珠,室温浮育2h,轻轻混匀。

6. 再次洗涤后,用含0.01%硫柳汞的PBS重悬微珠。

7. 检测微珠样品与抗体交联前后的交联效率,将样品分别加入Laemmli样品缓冲液中煮沸。分别取出相当于lml和9m1的两种样品,在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,用考马斯亮蓝染色。结合前样品呈现重链区带(分子量为55kDa),而结合后样品则无,表明交联成功。

~undefined亲和层析柱在含硫柳汞缓冲液中置4℃可保存1年以上。

制备好的微珠即可用于抗原的免疫亲和层析。

常见问题与解决方法

如果抗体的游离氨基位于与抗原结合的关键部位时,应用这种方法可能出现某些问题。此时,交联剂会与抗体的抗原结合片段结合而阻断其与靶抗原的相互作用。

当交联成功后,而事先的试验亦证明该抗体用于免疫沉淀是有效的,据此可以推断是由于交联过程破坏了抗体与抗原结合的活性。出现这种情况时,可采用两种办法解决:使用较少量的交联剂,以减少与抗体的抗原结合片段的作用,或者使用不依靠-NH2 基团的其他双功能交联剂。上述方法可以先用小量的抗体与蛋白A或蛋白G进行交联试验,操作过程类似于下面将要介绍的方法。

值得注意的是在使用此类亲和层析柱纯化抗原时,柱内残留有没有与抗体交联的少量蛋白A和蛋白G分子,会与抗原制品中存在的无关抗体发生结合。因此,当此类层析柱用于纯化来自哺乳类动物抗原时,可能在纯化的抗原中出现抗体,是由于在纯化的抗原中混杂有重链和轻链多肽造成的。开始时可用不含有抗体的抗原制品进行纯化,或者是在抗原纯化之前或纯化后通过蛋白A或蛋白G层析柱去除制品中混杂的抗体,可以避免这类问题的发生。

有时交联反应不完全,一般出现在使用贮存不当的DMP时,或者是在抗体制品中含有其他带有游离氨基的化合物。在检测交联效果时,如发现少量的重链即说明有交联不完全,可先用100mmol/L甘氨酸(pH2.8)洗涤交联的微珠,可以去除任何非共价结合于蛋白A或蛋白G分子上的抗体。如果问题很严重,必须在设置对照的情况下重新进行交联反应,以判断哪个步骤出现问题。此类问题通常出现在使用贮存不当的DMP,或由于洗涤和交联缓冲液的pH值太低。

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