抗体-蛋白A或-蛋白G微珠层析柱的制备

蛋白A或蛋白G微珠-抗体层析柱是免疫亲和层析技术中最常用的微珠基质之一。此类层析柱容易制备，由于抗体分子是通过Fc段与微珠基质结合，抗原结合片段（Fab）可与抗原最大限度地发生作用。以下介绍的方法可用于蛋白质抗原的纯化，但类似的方案也适用于任何其他抗原。

抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力，可以选用蛋白A或蛋白G微珠。一般推荐将蛋白A用于与小鼠单抗IgG2a，IgG2b和IgG3亚类抗体交联，而将蛋白G用于IgGl类抗体。蛋白G用于与大鼠单抗的交联，对于各种多克隆抗体，蛋白A适用于家兔、人、猪、脉鼠、狗或猫的抗体，而蛋白G适用于小鼠、大鼠、绵羊、马、驴、牛或山羊的多克隆抗体。

一旦抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合后，再通过双功能结合剂将其交联。双功能结合剂的种类很多，但通常使用二甲基庚二酸酯（DMP），因其价廉而且易于操作。DMP的两种结合基团相同，都能与游离的氨基结合，由于其碳分子骨架的韧性大，大多数抗体-蛋白A或蛋白G组合在合适的距离内存在反应位点，故能有效地交联。偶然不能有效交联，可以使用带有不同长度碳原子空隙的其他交联剂。

准备工作

应用抗体亲和层析柱对各种蛋白质进行纯化时，最关键是在尽量温和的条件下将抗原从柱上洗脱下来，这样才能保持蛋白质的结构和/或功能不发生变化。连接抗原和抗体的结合键的类型和数量是决定了洗脱的难易程度。在制备层析柱用于大规模纯化之前，有必要对所有可利用的抗体进行测试，并从中选择适当的抗体来制备亲和层析柱。

~undefined将抗体结合到蛋白A或G微珠时，建议不要直接将抗体溶液流经蛋白A或G微珠层析柱，因为这样会使抗体形成一个浓度梯度，层析柱上面的浓度高，而下面的浓度低。为避免这种情况，应将抗体与微珠混合成泥浆状而使其结合。

试剂和特殊设备

1. 抗体；

2. 蛋白A或蛋白G微珠；

3 0.2mol/ml硼酸钠(pH9.0)和0.2mol/L乙醇胺(pH8.0)及PBS；

4. 二甲基庚二酸(DMP)和考马斯亮兰；

5. Laemmli 样品缓冲液：将4ml 10% SDS、2ml 甘油、1.2ml 1mol/L Tris（pH8.0）加入2.8ml蒸馏水中，加入0.01%溴酚兰作为指示剂，室温保存。使用时取上述液体5份，蒸馏水4份，1mol/L DTT 1份混合。

6. 摇床

操作步骤

1. 将抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合：一般使用的层析柱，每毫升湿的微珠大约可结合2mg的抗体。将抗体与蛋白A或G微珠混合，使成为一种稀薄的浆状。在10ml溶液总量中大约含lml微珠。轻轻振荡混匀，室温孵育1h。

如前所述，免疫亲和层析柱一般用单抗或经过亲和层析的多抗制备。也可以用不同来源的抗体，包括杂交瘤细胞培养上清、腹水、纯化的抗体溶液等。由于这些抗体能够与蛋白A或G微珠特异性结合，此步骤可以去除溶液中的其他物质。如果须知道与微珠结合抗体的准确量，在与微珠结合之前应对抗体进行纯化。

2. 用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠缓冲液(pH9.0)洗涤微珠2次，以3000′g离心5min，或10000′g离心30s。

3. 用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠，并取出相当于10ml微珠的混悬液。加足量的DMP(固体)至终浓度为20mmol/L。

~undefined如用DMP交联，应为pH 8.3以上。

4. 轻轻混匀，室温孵育30min，取出相当于10ml已交联的微珠。

5.用0.2mol/L乙醇胺洗涤微珠1次，以终止反应。然后用0.2mol/L乙醇胺重悬微珠，室温浮育2h，轻轻混匀。

6. 再次洗涤后，用含0.01%硫柳汞的PBS重悬微珠。

7. 检测微珠样品与抗体交联前后的交联效率，将样品分别加入Laemmli样品缓冲液中煮沸。分别取出相当于lml和9m1的两种样品，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，用考马斯亮蓝染色。结合前样品呈现重链区带（分子量为55kDa），而结合后样品则无，表明交联成功。

~undefined亲和层析柱在含硫柳汞缓冲液中置4℃可保存1年以上。

制备好的微珠即可用于抗原的免疫亲和层析。

常见问题与解决方法

如果抗体的游离氨基位于与抗原结合的关键部位时，应用这种方法可能出现某些问题。此时，交联剂会与抗体的抗原结合片段结合而阻断其与靶抗原的相互作用。

当交联成功后，而事先的试验亦证明该抗体用于免疫沉淀是有效的，据此可以推断是由于交联过程破坏了抗体与抗原结合的活性。出现这种情况时，可采用两种办法解决：使用较少量的交联剂，以减少与抗体的抗原结合片段的作用，或者使用不依靠-NH2 基团的其他双功能交联剂。上述方法可以先用小量的抗体与蛋白A或蛋白G进行交联试验，操作过程类似于下面将要介绍的方法。

值得注意的是在使用此类亲和层析柱纯化抗原时，柱内残留有没有与抗体交联的少量蛋白A和蛋白G分子，会与抗原制品中存在的无关抗体发生结合。因此，当此类层析柱用于纯化来自哺乳类动物抗原时，可能在纯化的抗原中出现抗体，是由于在纯化的抗原中混杂有重链和轻链多肽造成的。开始时可用不含有抗体的抗原制品进行纯化，或者是在抗原纯化之前或纯化后通过蛋白A或蛋白G层析柱去除制品中混杂的抗体，可以避免这类问题的发生。

有时交联反应不完全，一般出现在使用贮存不当的DMP时，或者是在抗体制品中含有其他带有游离氨基的化合物。在检测交联效果时，如发现少量的重链即说明有交联不完全，可先用100mmol/L甘氨酸(pH2.8)洗涤交联的微珠,可以去除任何非共价结合于蛋白A或蛋白G分子上的抗体。如果问题很严重，必须在设置对照的情况下重新进行交联反应，以判断哪个步骤出现问题。此类问题通常出现在使用贮存不当的DMP，或由于洗涤和交联缓冲液的pH值太低。