抗原与抗体-微珠基质的结合

互联网2010-12-02

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抗原与抗体-微珠基质的结合

虽然使抗原有效地结合到免疫亲和柱上的方法很多，因为抗体是通过共价键交联在微珠上，而不是游离于溶液中，所以交联在微珠上的抗体与抗原结合所需的时间比抗体和抗原二者以游离状态在溶液中所需的时间要长得多，因此，选用的方法应使抗原与交联的抗体达到最大程度的结合。推荐使用两种结合方法：将抗原溶液加入呈糊状的抗体-微珠内，不断混和均匀；或将抗原溶液流经抗体-微珠层析柱，保持抗原与抗体尽可能长时间的接触。一般情况下，应首先选择在抗体-微珠层析柱内结合。若是结果不够理想，可以试用在溶液中结合。先用几支小型层析柱测试最佳结合和收集抗原的条件。

将抗原结合到抗体-微珠基质上之前，应注意抗体的亲和力与抗体-微珠基质结合抗原的容量或能力。

（1）亲和力

虽然抗体对抗原的精确亲和力可以计算，但对一般说来，实用的标准是抗体是否可以将抗原从溶液中分离出来。最简单的方法是建立一个小规模的预实验，测试待纯化的溶液液中抗原的含量。如果抗体-微珠基质在l~2h内不能分离出大部分抗原，可以在实验设计时作一些变动。例如使微珠上交联更多的抗体、或增加微珠的用量、或延长结合时间，均有可能增加结合抗原的量。但这些条件变化也可能增加非特异性结合，所以一般应综合考虑获得最高的结合抗原量和最低的非特异性结合。另一方面，使用高亲和力的抗体可以解决有效收集抗原量少的问题。其次使用稀释的溶液，相对较低的浓度和较短的结合时间，这些条件都可降低非特异性结合。

（2）测定层析柱基质结合抗原的能力

首先要确定层析柱基质体积与结合抗原量的比值。可以采用免疫沉淀法。将等体积的抗体-微珠基质加到含不同浓度抗原的样本中，在4℃中混合1h，以后的过程同标准免疫沉淀试验。如果能够在上述反应上清中测得抗原的量，也可以计算出被结合的抗原量。这样就可以得出结合所需量抗原必需的层析柱基质体积。