在混悬液中结合：抗体-微珠匀浆法

 

这是一种使抗体-微珠基质快速捕获抗原的方法，将抗原溶液与微珠混合，搅拌或振荡制成匀浆。这种方法可使抗原与固相化的抗体最大限度地接触。结合反应完成后，将匀浆装入层析柱内，以便收集结合有抗原的抗体-微珠和洗脱抗原。此法可以很好地控制反应时间，充分的利用了抗体结合容量。这比上面介绍的直接用层析柱捕获抗原方法麻烦一些。主要是因为用匀浆装柱比较困难；另一个问题是在混匀过程中会增加抗原溶液中变性蛋白的量，所以使用这种方法的纯化效果可能要差一些。

准备工作

在开始工作前，要考虑装填微珠的层析柱的类型及大小。既要考虑容易获得陡峭的洗脱峰，又要方便匀浆装柱。

溶液和特殊设备

1. 结合缓冲液（通常为PBS）

2. 摇床和简单的层析设备

操作步骤

1. 将抗体-微珠基质加入抗原溶液内。所加微珠的体积应通过预试验确定，调整微珠的用量，使其在结合反应所需时间内能够结合所有的抗原。微珠的最终浓度大约为lml湿珠加到10~20ml溶液中。

2. 4℃孵育微珠-抗原匀浆，并轻轻混合。常用的方法是在一封闭的容量中振荡或置平板摇床上涡旋混匀。孵育时间根据步骤1的预试验确定，预试验时可以从孵育2h开始。

3. 将微珠匀浆转移到合适大小的层析柱中。将匀浆倒入柱内，并用抗原稀释缓冲液洗下混合容器中残留的微珠，将洗涤液一道加入柱内。

4. 用20倍柱床体积的结合缓冲液（即PBS）洗涤微珠。

此时制备好的层析柱可进行进一步洗涤或洗脱(见下述)。

常见问题与解决方法

这种方法最大的问题是蛋白质非特异地结合到微珠上。这些蛋白可在洗脱时出现，从而使纯化效率降低。基质本身和抗体-基质复合物表面都可以非特异地结合抗原溶液中的蛋白质，尽管这些反应一般要比抗体-抗原间的反应弱，但在待纯化的抗原制品中有过量的非特异性蛋白就将影响纯化效果。

以下几种方法可使非特异性结合降到最低限度。

首先，如同其他亲和层析法一样，所用基质的量必须调整到刚好在其结合纯化制品中所有抗原的水平上，使纯化后的抗原溶液中非特异性蛋白的量尽可能降低。微珠的用量可通过预试确定，并可以测定不同体积的抗体-微珠基质捕获抗原的量。

第二种方法是降低层析柱的非特异性吸附量。许多吸附到柱基质上的蛋白质是部分或全部变性的蛋白。在制备抗原溶液时，机械性应力要尽可能小。在结合阶段，用机械振动使微珠保持混悬状时，动作亦应尽可能轻，并避免过度与空气接触。另一种非特异性吸附是由于某些颗粒性物质，在将微珠转移到柱中后，可被柱基质截留。在将抗原溶液加入微珠之前，先将抗原溶液经过100000′g离心30min，可去除制品中的颗粒物质。

第三种降低洗脱液中其他非特异性蛋白的方法是在装好柱后用缓冲液洗涤微珠，以去除非特异性蛋白。任何不干扰抗原抗体反应的缓冲液都可以用于消除非特异性结合。