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    细菌中制备抗体

    相关实验：细菌中制备抗体实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    8. 2 所需材料 (1) 0.2 cm 狭 缝 电 转 杯 （ B T X ， S a n D ie g o , C A ) 0 (2) I .O m o l/L H3PO4o (3) I . O m o l/L T ris 减 ， p H 8. 0 。 (4) I .O m m o l/L H e p e s ， p H 7. 4 (4. O m l， p H 7. 4 的 I .O m o l/L H ep es 加 人 到 4. O L U S P 超 纯 水 中 ，过 滤 除 菌 ）。 ( 5 ) 3, 3 /， 5 , 5 ' 四 甲 基 对 二 氨 基 联 苯 / H 20 2 过 氧 化 物 酶 （ T M B ) 底 物 （ K ^■k eg aard & Perry L a b o rato ries, G a ith ersb u rg, M D ) 0 (6) 1 0 % (V A O 超 纯 甘 油 （100m l 超 纯 甘 油 加 入 900m l U S P 超 纯 水 中 ，过 滤 除 菌 ）。 (7) 10m m ol/ L 5 ’腺 苷 - 三 憐 酸 盐 （ A m ersh a m -Pharm acia， P iscata w a y, N J) 。 (8) 1 0 X 聚 合 酶 链 反 应 缓 冲 液 （600 m m o l/L T ris-H c l， p H 8. 3 ， 250 m m o l/L KC1， 15m m o l/L M g C l2 ， 1 % T riton X -1 0 0 ， 100 m m o l/L 琉 基 乙 醇 ）。 (9) 1 0 X T M 缓 冲 液 （0. I m o l/L M g C l2 ， 0. 5 m o l/L T r i s ， p H 7. 5 ) 。 (10) lO O m m o l/L d N T P 混 合 液 （ 包 含 d A T P 、 d C T P 、 d G T P 、 d T T P 各 25m m o l/ L ) (A m ersh a m -Pharm acia) 〇 (11) 96 孔 免 疫 吸 附 板 （96-w e ll M axisorp im m u n op lates;N U N C , R o sk ild e， D enm ark) 〇 (12) 96 孔 微 管 （ V W R ， C h ica g o , IL ) 。 (13) lO O m m o l/L H C 1。 (14) lO O m m o l/L 二 巯 基 乙 醇 （ D T T ) (S ig m a , S t. L o u is， MO)〇 (15) 2Y T 培 养 基 （ I O g 酵 母 提 取 物 ， 16g 蛋 白 胨 ， 5 g N a C l ，加 水 至 1L ; 用 N a O H 调 节 p H 为 7. 0 ; 高 压 灭 菌 ）。 (16) 2Y T / car b /c m p 培 养 基 （2 Y T ， 5 ( ^ g /m l 羧 苄 青 霉 素 ， 5/x g /m l 氯 霉 素 ）。 (17) 2Y T / ca rb /k a n 培 养 基 （2 Y T ， 50ju g/m l 竣 节 青 霉 素 ， 25p g /m l 卡 那 霉 素 ）。 (18) 2 Y T / carb/ kan /u ridin e 培 养 基 （2Y T ， 50jn g/m l 羧 节 青 霉 素 ， 25ju g/m l 卡 那 霉 素 ， 0. 25jug/m l 尿 嘧 啶 核 苷 ）。 (19) 2Y T/Carb/K 〇 7 培 养 基 （2Y T ， 50； x g /m l 羧 苄 青 霉 素 ， 1 01° 个 噬 菌 体 Anl M13K07) 。 (20) 2 Y T /t e t 培 养 基 (2Y T ， 5/ u g /m l 四 环 素 ）。 (21) 2Y T / carb/t et 培 养 基 （2Y T ， 5(V g /m l 羧 苄 青 霉 素 ， lO p g /m l 四 环 素 ）。 (22) 2Y T / carb/tet/ K 0 7 (2Y T ， 50 ju g/m l 羧 苄 青 霉 素 ， lO p g /m l 四 环 素 ，101。个 嗤 菌 体 /m l M 13K 0 7 ) 。 (23) 2 Y T /k a n 培 养 基 （2 Y T ， 25/u g /m l 卡 那 霉 素
    (24) 2YT/kan/tet 培 养 基 （2Y T ， 25/zg/ml 卡那霉素， 5/ig/ml 四环素）。 (25) 2Y T 顶 层 培养基（16g 蛋白胨， IOg酵母提取物， 5gN aC l， 7. 5g 琼脂粉，加水 至 1L ，用 NaOH调 节 p H 到 7. 0,加热溶解，高压灭菌）。 (26) A m p liT a q D N A 聚 合 酶 （ A pplied B io sy ste m s， H a y w a r d ， C A ) 〇 (27) 竣节青霉素(5mg/ml，水溶，过滤除菌）。 (28) 氯 霉 素 （50mg/m l溶于乙醇）。 (29) 完全 C.R.A.P. 培 养 基 [3. 57g (NH4)2SO4, 0.71g NaCitrate-2H2O ，1.07g KC1， 5. 36g 酵母提取物， 5. 36g Hycase SF-Sheffield. 用 KOH 调 pH 到 7 . 3 , 加水到 I . 〇 L , 局压灭菌，冷却至 55° C 。加 IlOml I.Omol/L MOPS, pH 7. 3 ， Ilml 5 0 % 葡萄 糖 ， 7ml I.Omol/L M g S O 4L (30) E C M -600 电转仪（ B T X ) 。 (31) E . coli 34B8 (S tratagen e, La J o lla , C A ) 〇 (32) E . coli CJ236 (N e w E ngland B io la b s, B e v e rly , M A ) 〇 (33) E . coli M C 1061 (Bio-R a d , H e rc u le s, C A ) 〇 (34) £ . co“ X L 1-b lu e (Stratagene) 。 (35) E Z -L in k N H S -SS-生 物 素 （ P ierce， R o c k fo r d ， IL ) 。 ( 3 6 ) 过 滤 器 （ N algen e N u n c ， R o ch ester, N Y ) 。 ( 3 7 ) 勾 架 器 ， T -50 U ltra -T u rra x 型 （ Janke & K u n k e l， S ta u fe n ， G erm an y) 。 ( 3 8 ) 辣 根 过 氧 化 物酶标记的抗M 1 3 抗 体 （ A m ersh a m -Pharm acia) 。 (39) 卡那霉素（5 mg/ml，水溶,过滤除菌）。 (40) LB/carb平 板 （ L B 琼脂， 50jMg/m l竣节青霉素）。 (41) L B /t e t 平 板 （ L B a g a r, 5 ju g/m l 四环素）。 (42) M13K07 辅 助 噬 菌 体 （ N ew England Biolabs)。 (43) 2in 磁力搅拌子浸泡于乙醇中。 ( 4 4 ) 微 射 流 乳 化 处 理 器 ， M -I lO Y 型 （ M icro flu id ics， N e w to n ， M A ) 〇 (45) N eutravidin (P ierce) 0 ( 4 6 ) 憐 酸 盐 缓 冲 液 （ P B S ) ( 137m m o l/L N a C l， 3m m o l/L K C l , 8m m o l/L N a 2H P O 4 ， I .5m m o l/L K H 2P O 4. 用 H C l 调 p H 到 7. 2 ， 高压灭菌） 。 (47) P B S ， 0 . 2 % 牛 血 清 白 蛋 白 （ B S A ) 。 (48) P B S/B S A /T w e e n 缓 冲 液 （ P B S ， 0 . 0 5 % T w e e n -20, 0 . 2 % B S A ) 。 (49) P T 缓 冲 液 （ P B S ， 0. 0 5 % T w een -20)。 (50) P C R clean up m ix ( 外 切 核 酸 酶 I 和 奸 减 性 憐 酸 酶 ） （ U n ited States Biochem ic a l， C levela n d ， O H ) 〇 (51) P E G /N a C l [ 2 0 % P E G -8000 (w A O , 2. 5m o l/L N a C l，混合后高压灭菌]〇 (52) Protein A -琼 脂 糖 树 脂 （ A m ersh an -Pharm acia) 。 (53) Q IA p rep Spin M 13 K it (Q ia g e n ， V a le n c ia ， C A ) 0 (54) Q IA q u ick G el E xtraction K it (Q iagen ) 0 (55) 重 悬 缓 冲 液 （ PBS， 25mmol/L EDTA，蛋白酶抑制剂混合物）（ Roche， Indianapolis ， I N )
    (56) SOC培 养 基 [5g 细菌酵母提取物， 20g 细菌蛋白胨， 0. 5g N aC l， 0. 2g KC1，加 水 至 I .OL，用 N a O H 调 p H 至 7.0,高压灭菌后加入5.0 m l高 压 过 的 2. Om ol/L M gCl2 和 20m l过滤除菌的1.0 m〇l/L 葡萄糖]。 (57) Superbroth培养基（12g 胰蛋白胨， 24g 酵母提取物， 5m l甘油；加水至900m l，高 压灭菌后加入 IOOml 高压过的 0. 17m o l/L K H 2PO4， 0. 72m o l/L K 2HPO4)。 (58) Superbroth/tet/kan 培 养 基 （Superbroth 培养基， 5mg /m l 四环素， 25m g/m l 卡那霉素）。 (59) T 4 多聚核苷酸激酶（New England Biolabs)。 (60) T 4 D N A 连接酶（ Invitrogen， Carlsbad， C A)。 (61) T 7 D N A 聚合酶（New England Biolabs)。 (62) T A E 缓冲液(40mmol/L T ris -乙酸盐， I .Ommol/L E D T A ; 调 pH 到 8. 0,高压 灭菌）。 (63) T A E /琼脂糖凝胶[T A E 缓冲液， 1.0% (W/V )琼脂糖， 1 : 5000 (V7 V ) 1 0 % 溴化乙锭]。 (64) 四环素（5mg/m l，水溶，高压灭菌）。 (65) 超纯 USP 水 （Braun M edical， Irvin e , CA)。 (66) 尿嘧啶核苷(25mg/m l，溶于水，过滤除菌）。 (67) 超 纯 甘 油 （ Invitrogen)。 8. 3 方法 下面内容详细描述了所有用于分离抗原特异性抗体的噬菌体展示文库的构建和使用 方法。首先设计一个表达抗体的骨架部分的噬粒，然后在抗体互补决定簇位点装进不同 的基因组合而构成能产生不同抗原表位的抗体文库。在大肠杆菌宿主中传代后，基因文 库转变成噬菌体展示的蛋白质文库，而且文库产生的噬菌体群可用于抗原特异性克隆的 筛选。这些克隆的结合特性可直接以噬菌体颗粒形式进行检测。蛋白质序列可以通过测 定噬菌体携带的编码D N A 序列进行推导。最 后 ，对感兴趣的抗体可以纯化出游离蛋白 质以备后续分析使用。 8. 3.1 噬粒设计 我们通常使用一种特殊的噬粒载体进行噬菌体展示抗体文库的构建（ 图 8. 3)，如经 适当考虑，载体可以改建以便更适于游离蛋白质的制备、纯化和分析。噬粒载体包含一个 双 链 D N A 复制起点（ d sD N A ori) ,使之能在大肠杆菌中像质粒一样复制；同时还带有一 个 单 链 D N A (s s D N A )丝状噬菌体复制起始点（f l 〇r i)允许噬菌体颗粒包装。我们描述 了一个多功能的嗟粒载体，它已经用于抗体Fab[18]、scFv[37]、V H 结构域[21]以及其他蛋白 质和多肽[26’ 27]的噬菌体展示。载体中带有提供青霉素（ 包括氨苄青霉素和羧苄青霉素） 抗性（ A m pO 的 P-内酰胺酶基因（6 ^ ) ，当然也可以选用其他的抗性标记物。载体的最后 一 个组成部分是在碱性磷酸酶启动子（ P ^/u>A )调 控 下 的 D N A 盒 ，负责表达需要展示的 抗体。我们曾经使用碱性磷酸酶启动子展示过F a b 片段[18]，该启动子非常适合F ab蛋白
    的表达和纯化。当然也可以选择其他启动子。例如，我们曾经将异丙基1-硫-[H > 吡喃型 葡萄糖苷诱导的Ptac启 动 子用于scFvs和 V h 结构域[21’ 37]的噬菌体文库展示。在展示 单 链 的 scFvs和 V h 结构域时，D N A 盒编码一个融合蛋白，融合蛋白中首先是一段分泌 信 号 ，其后为需要展示的蛋白和M 1 3 噬 菌 体 基 因 3 微壳蛋白（ protein-3, P3)的 C 端结 构 域 。如果展示抗体F a b 片 段 ，情 况 则 会 复 杂 一 些 ，因为该蛋白质是一个异源二聚嵌 合 体 ，必须使用一个双顺反子表达系统。该 表 达 体 系 中 ，重链与噬菌体衣壳蛋白融合 表 达 ，轻链独立表达。每条链都要和分泌信号融合表达，以保证二者表达后都能直接 分泌到胞质中并且在胞质中形成异源二聚嵌合的抗体F a b 片段，随后展示在噬菌体的表 面 。噬粒在大肠杆菌宿主中像双链质粒一样复制。在辅助噬菌体（ 如 M 13K 0 7 ) 的协同 感染下，ssD N A 复制启动，噬 粒 ssD N A 优先包装形成噬菌体颗粒。从噬菌体中很容易纯 化 出 ssDNA，用于测序、突变以及建库等工作(见下述部分）。尽管辅助噬菌体提供了所有 包装必需的蛋白质，但还是有几拷贝的噬粒编码的衣壳蛋白也掺人了包装的病毒颗粒中。 这样编码抗体片段的D N A 就和被展示在病毒粒子表面的与噬粒编码的衣壳蛋白融合的抗 体多肽建立了联系。包装的噬菌体颗粒形成一个文库并可用于特异性抗体的筛 选 。 图 8 . 3 设计用于Fab展示的噬粒载体。该载体带有一个单链DNA复制起点（ flori)，一个双链DNA 复制起点（ dsDNA ori)以及一个选择性标记物，如提供青霉素抗性（AmpO的 P -内酰胺酶基因。在 Fab 的噬菌体展示中，噬粒带有的DNA盒（ DNA cassette)中包含启动双顺反子信息转录的启动子，双顺反 子编码轻链(Vl-Cl)以及重链的可变区和恒定区1(VH -CH 1)。每条链的N 端与分泌信号（ SS)融合，重 链 的 C 端还与噬菌体衣壳蛋白融合。轻链和重链在胞质中装配形成功能性的Fab片段。该片段掺人 噬菌体颗粒中被£. 宿主分泌到细胞外。 8 . 3 . 2 文 库 构 建 优化使用K im k e l等的经典寡核苷酸定点突变技术[18’ 37’38」可以快速构建大容量（> 101°个）的噬菌体展示抗体文库（ 图 8. 4)[39]。首先使用寡核苷酸突变技术在序列中随机 引人终止密码子。因为终止密码子的存在可以消除野生型（ w t)蛋白质的展示，所以将产 生的“终止模板”噬粒作为文库构建的模板。含有尿嘧啶的ssDNA (dU-ssDNA)终止模 板 ( 从 大 肠 杆 菌 株 纯 化 获 得 ）与带有适当简并密码子的突变寡核苷酸退火以 替代序列中的终止密码子。例如，N N K 简并密码子编码了所有2 0 种氨基酸。也可以使
    用其他的简并密码子，但是使用的密码子仅限于在天然抗体中常见的氨基酸[18’ 37]或者特 别适合于抗原识别的氨基酸[4°’ 41]子集。诱变寡核苷酸通常先启动合成一条互补的DNA 链 ，再连接形成共价闭环双链DNA (共价闭环 dsDNA)杂化双链。共 价 闭 环 dsD N A杂 化双链以电转化的方式转人大肠杆菌D 如+ A m g+ 株 。在宿主菌中，该异质性发生错配或 者被修复回到野生型或者保留了突变序列。在大肠杆菌Mng+ 株中含尿嘧啶的模板链失 活 ，合成的突变链得以复制，因而可以获得高的突变率( > 5 0 % ) 。随机引人了终止密码子 的模板使得只有实现了完全诱变的克隆才能在噬菌体上展示，因为只有这些克隆才带有 编码与噬菌体衣壳蛋白融合的全长蛋白质的可读框。在辅助噬菌体对大肠杆菌的协同感 染 下 ，文库成员得以包装形成噬菌体颗粒。 ★ 图 8 . 4 应用寡核苷酸定点突变技术进行文库构建。人工合成的寡核苷酸（ 箭头）与含尿嘧啶的单链 DNA模板(实心圆）退火。该例中，三组不同的寡核苷酸与重链可变结构域（ 灰色盒）退火，在三处区域 (H1、H2 和 H3)的互补链中引人突变。设计引人突变（_~B的寡核苷酸的每处错配区两侧都是严格互补 配对的序列。在 T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶（ 虚线圆）的作用下合成了杂化双链共价闭合环状 DNA分子。该环状双链DNA分子被转入大肠杆菌后，错配区域或者被修复回到野生型序列或者保留 突变序列。因为模板的突变区（ X)带有终止密码子，所以只有被诱变的寡核苷酸修复了所有终止密码子 的克隆才能够展示Fab蛋白。 8. 3. 2. 1 含 尿 嘧 啶 的 单 链DNA模板纯化 突变效率的高低与模板纯度密切相关，因此使用高纯度的d U -s s D N A 对成功构建文 库十分关键。我们使用Qiagen QIAprep Spin M 13 K i t 进 行 d U - s s D N A 的纯化。以下是 Qiagen操作程序的优化版，可以从一个中等拷贝量的噬菌粒载体（ 如 以 pBR3 2 2 为骨架 的载体）制备含尿嘧啶的单链D N A 模 板 ，产量至少可达20m g，足够构建一个文库。 ( 1 ) 从一个新鲜的LB/carb平板上挑取带有噬菌粒的大肠杆菌CJ236 (或另外一个 dut—/ung— 表型的菌株）单 克 隆 ，接 种 到 I mI 2Y T 培 养 基 中 ，该 培 养 基 中 带 有 M 13K 07 辅助噬菌体（ K^ pfu/m l)以及抗生素以维持宿主F 游离基因和噬菌粒在宿主菌中的存 在 。例 如 ，2Y T /Carb/cmP 培养基带有羧苄青霉素以选择带有p_内酰胺酶基因的噬菌粒， 氯霉素则选择大肠杆菌CJ2 3 6 的 F 游离基因。
    (2) 37°C ，200r/m in 振 荡 培 养 2h ，添 加 卡 那 霉 素 （25Fg/m l) 以 筛 选 共 感 染 了 M 13K 0 7 的克隆，这些克隆中带有卡那霉素抗性基因。 (3) 37°C ，200r/m in 振摇 6h ，将培养物转移到 30ml 2Y T /carb/kan/uridine 培养基中。 (4) 37°C ，200r/m in 振摇 20h 。 (5) 4°C ，15 000r/m in(27 OOOg)离心 lO m in，转头 Sorvall SS-34 型 。转移上清液到一 新管中，新 管 内 有 1/5体积的PEG/N aC l，室温孵育5m in。 (6) 4°C ，10 000r/m in(12 OOOg)离心 lO m in，转头 SS-34 型 。弃 上 清 液 ，4 OOOr/min (2000g )简单离心，吸走残留的上清液。 (7) 重悬曝囷体沉淀于0 •5ml P B S 中并转移至I .5m l微量离心管中。 (8) 微量离心机中，13 OOOr/m in 离 心 5m in ，转移上清液至I .5m l微量离心管中。 (9) 加 入 7. Opl M P 缓冲液（ Q iagen)混匀，室温孵育至少2m in。 (10) 样品加入QIAprep spin column (Qiagen)中，该吸附柱套在一个2m l微量离心 管中。微量离心机,8000r/m in 离 心 30s，弃滤过液，噬菌体颗粒吸附在柱基质上。 (11) 加 0. 7ml M L B 缓冲液（ Qiagen)到吸附柱中，8 OOOr/m in 离 心 30s ，弃滤过液。 (12) 加 0.7ml M L B 缓冲液，室温孵育至少lm in 。 (13) 8000r/m in 离 心 30s，弃滤过液。 D N A 与蛋白质衣壳分离并吸附在柱基质上。 (14) 加 0.7ml PE 缓 冲 液 （ Qiagen) ，8000r/m in 离心 30s，弃滤过液。 (15) 重复步骤（14)，除去残留的蛋白质和盐。 (16) 换一个新的I .5m l微量离心管，8000r/m iri离 心 30s ，除去残留的P E 缓冲液。 (17) 将吸附柱转移到一个新的1.5m l微量离心管中。 (18) 将 lOOjul EB 缓冲液（ Qiagen; 10m m ol/L T ris-C l， pH 8. 5)加到吸附柱膜的中 心 ，室温醉育IOm in。 (19) 8000r/m in 离 心 30s，洗脱液保留，内含纯化的含尿嘧啶的单链D N A 。 (20) 取 I .Opl D N A 做 T A E /琼脂糖凝胶电泳分析，应为单一明亮的条带，但也常见 一些低电泳迁移力的微弱条带，这些条带可能是有二级结构的含尿嘧啶的单链D N A 。 (21) 260nm (A 26。= I .0 相 当 于 33ng/Ml 的 ssDNA)处测定吸光值，确 定 D N A 浓度， D N A 浓度范围通常为200〜500ng/； xl。 8.3.2.2 杂 化 共 价 闭 环 dsDNA的 体 外 合 成 以 dU -ssD N A 为模板通常经三步即可将诱变寡核苷酸掺入共价闭环d s D N A 杂化 链 。下述方案是一个已发表方法[39]经优化后的大规模制备版本。 5'磷酸化的寡核苷酸 与 一 条 dU -ssD N A 模板退火，寡核苷酸经酶促延伸并连接形成共价闭环d sD N A 杂化链 (图 8. 4)。之后该产物被纯化和脱盐。下述方案可制备约2(^g 高纯度、低电导率的共价 闭 环 dsD N A,足够构建超过101°个独特噬菌体水平的文库。 8.3.2.2.1 T4 多聚核苷酸激酶作用下的寡核苷酸鱗酸化 (1) 在 一 个 I .5m l微量离心管中混合0. 6/ug诱变的寡核苷酸，2. 0^1 IO X T M 缓冲 液 ， 2. Oyl 10m m ol/L A T P , I .0/xl 100m m o l/L D T T ，加水至总体积达 20W。 ( 2 ) 加 人 2 0 单 位 T 4 多聚核苷酸激酶，37°C孵 育 I .Oh后立即用于退火。
    8. 3. 2. 2. 2 寡核苷酸与模板退火 (1) 2 0 叫 的 dU -ssD N A 模板，加 人 254 IO X T M 缓冲液， 20^1每种已磷酸化的寡 核苷酸，加水至终体积250/xl。 如 果 D N A 中不止一处区域引入突变（ 如在多处区域的互 补链中引人突变），只要诱变寡核苷酸内部没有重叠序列，就可以将两个或更多个寡核苷 酸同时加入。如果寡核苷酸与模板的长度比值为1 : 100,则所用的寡核苷酸与模板量的 摩尔比应为3 : 1。 (2) 90°C孵育 3min， 50°C孵育 3min，最后 20°C孵育 5min。 8 . 3 . 2 . 2 . 3 共 价 闭 环 dsDNA的酶促合成 ⑴ 在 已 退 火 的 寡 核 苷 酸 /模 板 混 合 物 中 加 人 IO1^l l 〇 mmol/L A T P ， 1〇卩1lOOmmol/ L dNTP 混 合 液 ， 15/xl 100mmol/L D T T ， 30 Weiss 单位 T 4 DNA 连 接 酶 以 及 30 单位 T 7 D N A 聚 合 酶 。 (2) 20°C孵育过夜。 ( 3 ) 用 Qiagen QIA (quick DNA purification kit) 亲和纯化 DNA 并 脱 盐 。加入 I.Oml QG缓冲液（ Qiagen)并混合均匀。 (4) 将样品分两份加入两个QIAquick spin columns中，该吸附柱套在一个2ml微量 离心管中。微量离心机中，13 000r/min离 心 lmin，弃滤过液。 (5) 每个吸附柱中加人750/n l缓 冲 液 PE (Qiagen)，13 000r/min转速 离 心lmin 。 (6) 转移吸附柱到一个新的I.5m l微量离心管中，13 000r/min转速离心lmin。 (7) 转移吸附柱到一个新的I.5m l微量离心管中，在 膜 中 央 加 35/ uil超纯水，室温孵 育 2min〇 (8) 13 000r/min离 心 Imin洗 脱 DNA，合并两个吸附柱中的洗脱液。立 即 用 DNA 电转化大肠杆菌或者冷冻保存备用。 (9) 取 1.0^1洗脱产物进行电泳分析。带溴化乙键的T A E /琼脂糖凝胶检测分析，在 紫外灯下可见D N A 条带（ 图 8.5)。 图 8 • 5 共 价 闭 环 dsD N A 的 体 外 合 成 。带 溴 化 乙 锭 的 1 . 0 % TAE/琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 反 应 产 物 ，紫外 线灯下可见D N A 条带。泳 道 I : D N A 标准分子质量；泳 道 2 ••带尿啼啶的单链D N A 模板；泳 道 3 : 杂 化共价闭环dsDNA 的合成产物。低位条带（ C)是正确延伸并连接的共价 闭 环 d s D N A ，中间条带（B)是 缺 刻 dsDNA;最上方的条带（ A)是链置换的dsDNA。
    以 ssDNA模板为对照。一个成功的反应最终可以使ssDNA完 全 转 化 为 dsDNA。 通 常情况下至少可以在凝胶中看到两条条带，并 且 没 有 ssDNA的残留（ 图 8. 5)。 高电泳 迁移率的条带代表预期产物，为经过正确延伸和连接的共价闭环dsDNA，可以有效转化 大肠杆菌并能获得高的突变率(约8 0 % ) 。 低电泳迁移率的条带是T 7 D N A 聚合酶固有 的不利活性导致产生的链置换产物[42]。链置换产物的突变率低（ 约 2 0 % ) ，而且其转化大 肠杆菌的效率也比共价闭环dsDNA低 至 少 3 0 倍 。 如果有相当比例的单链模板转化为 共价闭环dsDNA，我们就可以据此获得一个高突变率的高度多样化的文库。有时候也可 以看到介于前述两种产物电泳迁移率之间的第三条条带。这条中等大小的条带代表正确 延伸但没有连接起来的dsDNA (缺刻dsDNA) ,形成这种产物的原因或者是T4 D N A 连 接酶的活性不够或者是寡核苷酸的磷酸化不完全。 8. 3. 2. 3 共 价 闭 环 dsDNA转入噬菌体展示文库 为完成文库的构建需要将杂化共价闭环dsD N A转 入 含 有 F2 游离基因的大肠杆菌 宿主中，该游离基因能保证M1 3 噬菌体成功感染和扩增。噬菌体展示文库的容量受限于 D N A 转入大肠杆菌中的方法，其中最有效的方法当数高压电转化法。我们构建了一株用 于高效电转化和生产嗟菌体的理想菌株大肠杆菌SS320株[43]。大 肠 杆 菌 MC1061株染 色体带有链霉素抗性基因，而 大 肠 杆 菌 X U -blu e株 的 F2 游离基因提供了四环素抗性。 将该两种菌株以标准方法进行细菌接合[44]，使大肠杆菌XLl-blue株 的 F2 游离基因转移 到大肠杆菌MC1061株中，筛选后代中具有链霉素和四环素双抗性的菌株。该菌株即为 大肠杆菌SS320株 ，既保留了大肠杆菌MC1061株电转化效率高的特点，又 因 存 在 F2 游 离基因保证了 M1 3 噬菌体能够感染成功。下面的优化方案适用于大肠杆菌SS320株感 受态细胞的大规模制备以及产生高度多样化文库的电转化过程。 8. 3. 2. 4 大 肠 杆 菌 SS3 2 0 株电转化感受态细胞的制备 下述方案可以制备大约12m l高 浓 度 的 被 M13K0 7 辅助噬菌体感染的大肠杆菌 SS320株电转化感受态细胞(约S X io11C fu A n lh 制备好的感受态细胞加入1 0 % 甘油 ，一 70°C备用。这些被辅助噬菌体感染的大肠杆菌感受态细胞 ，一 旦被噬菌粒转化就会产生 噬菌体颗粒。 (1) 从 新 鲜 LB/tet平板上挑取K c 0H SS320单克隆，接 种 于 25ml 2YT/tet培养基， 37°C ，200r/min振摇培养至对数中期（ OD550= O.8)。 (2) 将 20沁 M 13K 0 7 加 入 18〇 4 PBS中，连 续 1 0 倍稀释(每次稀释需换用新的吸头）。 (3)将 500W 对 数 生 长 期 的 SS320,20〇 iul不 同 稀 释 度 的 M13K0 7 以 及 4ml 2Y T 顶层琼脂混匀。 (4) 将混合物倾倒在预热的LB/te t平板上，37°C 生长过夜。 (5) 挑取一个独立噬菌斑接种在Iml 2YT/kan/tet 培养基中，37°C孵 育 8h。 ( 6 ) 将培养物 转 移 至 装 有 250ml 2YT/kan 培 养 基 的 2L 长颈震荡培养瓶中，37°C ， 200r/min振摇过夜。 (7) 将 5m l过夜培养物接种6 个 装 有 900ml superbroth/tet/kan培 养 基 的 2L 长颈 振荡培养瓶，37°C ，20〇 r/min振摇生长至对数中期（ OD55 q= 0 . 8 )
    (8) 三瓶培养物在冰上冷却5m in ，间或涡旋一次使之快速冷却。下述步骤需要在冷 室中冰上操作，需用预冷的溶液和设备。 (9) 4°C ，55 OOOr/min (5000g )离心 IO m in,转头 Sorvall GS-3 型 。 (10) 弃上清液，将瓶中残留的培养物加人同一离心管中（ 这些残留培养物在第一批 培养物离心时应该保持冷却状态）。 (11) 重复离心步骤，弃上清液。 (12) 离心管中装满pH 7 . 4 的 l .Ommol/L Hepes缓冲液，放入无菌磁力搅拌棒，中 速搅动,使沉淀物从管壁脱落，在管中重新完全悬浮。 (13) 4°C ，55 OOOr/min (5000容）离心 IO m in,转头为 Sorvall GS-3 型 。弃上清液，在 管中保留搅拌棒，避免搅动沉淀，保持离心管在转头中的位置。 (14) 重复步骤（12)和（13)。 (15) 150ml 1 0 % 的超纯甘油重悬每份沉淀，搅拌棒帮助重悬,但不合并沉淀。 (16) 4°C ，55 OOOr/min (5000g )离心 15m in ，转头用 Sorvall GS-3 型 。弃上清液并取 走搅拌棒。用吸头吸走残留的痕量上清液。 (17) 每管中加人3. Oml 1 0 % 超纯甘油重悬沉淀，吸头反复吹打混匀。将重悬液转 移到下一个离心管中，重复上述操作直到所有的沉淀重悬起来。 (18) 每 个 I .5m l微量离心管中分装350^1感受态细胞。 (19) 液氮速冻 ，一 70°C 保存。 8 . 3 . 2 . 5 大肠杆菌电转化和噬菌体扩增 (1) 冰上冷却20^g(最小体积)纯化的共价闭环d sD N A 和 0. 2c m 的狭缝电转杯。 (2) 冰上融化一份350/x l的 c〇H SS320株感受态细胞，加 入 D N A 中，吸头吸打几 次混匀（ 避免产生气泡）。 (3) 将混合物转移入电转杯中进行电转化。根据操作手册指示进行电转化，推荐使 用 BTX ECM-600电转系统，条件设置：2. 5k V 场强、1 2 9 0 电 阻 和 50jlx F 电容。或者使用 Bio-Rad Gene Pulser电转系统，条件设置：2. 5k V 场强、2〇〇 n 电阻和25;i F 电容。 ( 4 ) 电转化后立即向细胞中加人Iml SOC培养基，再将这带有转化细胞的iml SOC 培养基移人装有IOml SOC培 养 基 的 250m l长颈振荡培养瓶中。用 lml SO C 培养基淋 洗电转杯，洗两次，并入带有转化细胞的培养基中，补 加 SOC培养基达终体积25ml。 (5) 37°C ，200r/m in 解育 30m in。 (6) 将文库连续稀释后接种在IJB/carb平板上筛选噬粒以鉴定文库的多样性。 (7) 将培养物转移至装有500ml 2Y T 培 养 基 的 2L 长颈振荡培养瓶中，培养基中添 加了筛选噬粒和M 13K 0 7 辅助噬菌体的抗生素（ 如 2Y T /Carb/k a n 培养基）。 (8) 37°C ，200r/min 孵育过夜。 (9) 4°C ，10 000r/m in(16 OOOgO离心 IO m in，转头 Sorvall GSA 型 。 (10) 转移上清液到一新离心管中，该 管 中 装 有 1 / 5 体 积 的 PEG/NaCl溶 液 ，以沉淀 噬菌体。室温孵育5min。 (11) 4°C ，10 OOOr/m in 离 心 lO m in，转 头 Sorvall G S A 型。弃上清液，再简单离心，用
    吸头吸走残留的上清液。 (12) 20ml P B T 缓冲液重悬噬菌体沉淀。 (13) 重悬液在4t ：，15 000r/m in(27 OOOg)离 心 5m in ，转 头 SS-34型 。转移上清液到 一新管中。 (14) 在 268n m 波长下测定吸光度，计算噬菌体浓度（ OD268= 1. 0 相当于溶液中噬 菌体浓度为5 X IO12个噬菌体/m l)。 (15) 可 立 即 进 行 文 库 筛 选 。或 者 将 文 库 中 加 入 甘 油 ，终 浓 度 达 1 0 % 后冻存在 —80°C 。通常来说，最好立即使用新鲜构建的文库，随着保存时间的延长，文库展示的蛋白 质质量会因蛋白质水解作用而呈量级式的降低。 8 . 3 . 3 抗 原 特 异 性 抗 体的 筛选 可以通过多种策略对噬菌体展示抗体文库进行抗原特异性抗体的筛选。这里提供了 两种最常见的方法。第一种方法是将嗟菌体展示文库与9 6 孔免疫吸附微孔板上固定化 的抗原进行孵育,第二种方法是将文库与溶液中生物素化的抗原进行孵育，随后被结合的 嗟菌体捕获在包被 Neutravidin (Pierce/Invitrogen， Carlsbad， C A ) 的 96 孔微板中。第 一种方法中，固相表面结合的固化抗原所产生的亲和效应可将有弱亲和性的配基同时筛 选出来。第二种方法中可以通过调整生物素化抗原的浓度提高筛选的严谨性，以筛选出 具有高亲和力的克隆。第一种方法常用于天然文库的筛选，第二种方法更适合于改进已 有抗体亲和性克隆的筛选。 8. 3. 3. 1 基于固定化抗原的筛选 ( 1 ) 以 IOOfjJ 抗 原 溶 液 （5/ixg/m l，溶 液 为 包 被 缓 冲 液 ）包 被 9 6 孔免疫吸附微孔板 (Maxisorp immunoplate) ，室 温 2h 或 4°C 过夜。应根据文库的多样性决定需要包被的板 孔数。理论上讲，噬菌体的浓度应大于IO13个噬菌体/m l，噬菌体总数应超过文库容量的 1000倍 。因此，如果文库容量为101。，则 需 要 IO13个噬菌体，如 噬 菌 体 浓 度 为 IO13个噬菌 体/m l,则共需要包被1 0 个孔。 ( 2 ) 除去包被液后，用 含 0.2% B S A 的 20〇 y PBS缓冲液封闭。同时对等数量的未 包被板孔进行封闭作为阴性对照。 ( 3 ) 除去封闭液并用P T 缓冲液洗4 次 。 ( 4 ) 每 个 包 被 和 未 包 被 的 孔 中 均 加 入 IOOjLtl的 噬 菌 体 文 库 溶 液 (P B T 缓 冲 液 中 ）。 室 温 孵 育 2 h ，轻 微 振 摇 。 (5) P B T 缓 冲 液 洗 1 0 次 ，除去噬菌体溶液。 ( 6 ) 加 入 IOOjUl 100m m o l/L H C l室 温 孵 育 5m in ，洗脱结合的噬菌体。转 移 H C l溶 液 到 I .5m l微量离心管中。 ( 7 ) 以 pH 8. 0 的 I .0m o l/L T ris-H C l 调节 pH 至中性。 (8) 将一半噬菌体洗脱液加人1 0 倍体积 生 长 旺 盛 的 大 肠 杆 菌 X Ll-B hie (OD550< 1. 0)中，培养基为 2Y T /te t。 37°C ，200r/m in 振摇培养 20m in。 (9) 将培养物连续稀释后在LB/ca rb 培养基上铺板，以确定洗脱噬菌体的数量。以
    抗原包被孔中洗脱的噬菌体数量除以未包被孔中洗脱的噬菌体数量计算富集率。 (10) 在该大肠杆菌培养物中加M 13K 0 7 辅 助 噬 菌 体 至 终 浓 度 101°个噬菌体/mi ， 37°C ，200r/m in 振摇孵育 45m in。 (11) 将培养物转到2 5 倍体积的2YT/carb/kan培养基中，37°C ，200r/m in 振摇孵育 过夜。 (12) PEG/N a C l溶液沉淀分离噬菌体，I .Oml P B T 缓冲液重悬沉淀，测定吸光度，计 算噬菌体浓度。 (13) 重复筛选步骤直到富集率达到最高。通常情况下富集筛选3〜4 轮即 可 ，很少 超 过 6 轮筛选。 ( 1 4 ) 挑单克隆测序并进行噬菌体E L I S A 。 8. 3. 3. 2 基于生物素化抗原的筛选 (1) 抗 原 与 EZ-Link NHS-SS-生物素连接进行生物素化。 (2) IOOjm I 的 Neutravidin溶液（5jug/ml，在包被缓冲液中）包 被 9 6 孔免疫吸附微孔 板 ，室 温 2h 或 4°C过夜。需要包被的板孔数由文库的容量决定。 ( 3 ) 除去包被液后，用 含 0.2% B S A 的 200jul P B S 缓冲液封闭。 (4) 将生物素化的抗原与L O m l噬菌体文库溶液（ 在 P B T 缓冲液中）在 一 个 I.5ml 的微量离心管中混合。由于降低抗原浓度可以提高筛选的严谨性，所以在接连几轮筛选 中可以适当降低抗原浓度（ 0. 1〜 l 〇nmol/L) 。 ( 5 ) 室温孵育2h ，轻微振摇。 (6) 每 个 N eutravidin包被的孔中加人100/^1噬菌体/抗原混合物。 (7) 室温孵育15m in，轻微振摇。 (8) P T 缓冲液洗1 0 次 ，除去噬菌体溶液。 (9) 加 人 100^1 100m m ol/L H C l室温孵育5m in ，洗脱结合的噬菌体。 (10) 转 移 H C l溶 液 到 I .5m l微量离心管中。以 pH 8. 0 的 I .Omol/L T ris -H C l调 节 p H 至中性。 (11) 在大肠杆菌XLl-blue株中扩增噬菌体用于后续几轮筛选。 8. 3. 3. 3 结合克隆的分析方法—噬 菌 体 ELISA 通过富集抗原结合克隆的筛选程序获得了一个噬菌体的集合，但在这个噬菌体群体 中可能也包含有未结合的克隆以及非特异性结合的克隆。可以通过检测噬菌体颗粒的抗 体量是否升高来反映噬菌体展示抗体与固化抗原的结合，而 ELISA则可用于分析噬菌体 展示抗体与抗原的特异性结合。带有噬菌体颗粒的培养基可直接用于噬菌体ELISA检 测 ，快速鉴别抗原特异性结合的克隆。可以通过竞争性的噬菌体ELISA来估测特异性抗 原结合克隆的亲和力。这 种 ELISA方法中，溶液中已知浓度的抗原竞争抑制了嗟菌体与 固化抗原的结合。该实验可以相对高通量的方式进行，通过单点竞争噬菌体ELISA^P 通过单一抗原浓度对结合的抑制程度来评估抗体的亲和力。该方法可以基于结合抑制的 百分比将许多独特克隆进行亲和力高低的排序，但是不能给出精确的评估。或者，可以应
    用一种 更 为 精 确 的 多 点 竞 争 噬 菌 体ELISA方 法 以 IC5。值 来 精 确 评 估 抗 体 的 亲 和 力 。 IC5。值定义 为 阻 断 5 0 % 噻 菌 体 抗 体 与 固化抗原结合的抗原浓度。多点竞争性噬菌体 ELISA方法包含两个步骤。首先，连续稀释抗原抗体溶液，滴定效价以确定在抗原包被 孔中产生可检测但是亚饱和信号的浓度。其 次 ，以连续稀释的抗原溶液竞争结合与固化 抗原结合的亚饱和状态的噬菌体。该方法可以提供一条剂量依赖性抑制曲线，用于确定 IC50值 。 8.3.3.3.1 直 接 结 合 的 噬 菌 体 ELISA (1) 在 9 6 孔微管中分装450jul 2YT/carb/K0 7 培养基，每孔中接种带有噬菌体的单 克隆，37°C ，200r/min振摇过夜。 (2) 4000r/miri离 心 IOmin,转移噬菌体上清液到新管中。 (3) 用 PBT缓冲液三倍稀释噬菌体上清液。 (4) 转 移 100^1稀释的噬菌体上清液到包被抗原的9 6 孔板中，之后如前所述用 b s a 封闭。另外还应同时设置无关蛋白包被的板子进行结合试验检测，或者仅以B S A 封闭板 子作为阴性对照。 (5) 孵 育 15min，轻微振摇。 (6) P T 缓冲液洗8 次 。 (7) 加 IOOmI 辣根过氧化物酶标记的抗M1 3 抗 体 （ PBT缓 冲液 中1 : 3000稀释），孵 育 30min，轻微振摇。 (8) P T 缓冲液洗6 次 ，PBS洗两次。 (9) 加 100/lJ 新鲜制备的T M B 底 物 ，显 色 5〜10 m in0 (10) 100^1 1.0 mol/L H3PO4 终止反应，450nm 波长下测定吸光度。 (11) 比较抗原包被板和B S A 包被板或者其他蛋白质包被板上的信号强度评估结合 的特异性。 8.3.3.3. 2 单 点 竞 争 噬 菌 体 ELISA (1) 如前所述培养和收获噬菌体。 (2) 单 独 用 PB T 缓冲液或者含有抗原的P B T 缓冲液（ 抗原浓度与预期抗体亲和力 相近）5倍稀释噬菌体上清液。 (3) 孵 育 I h 后各转移IOOW到包被抗原的96孔板上，之后如前所述进行BSA封闭。 (4) 孵 育 15min，轻微振摇。 (5) 如前洗板，显色，读板。 (6) 计算每个克隆未与溶液相抗原结合的抗体比例。以有溶液相抗原的A45q值除以 无溶液相抗原的A45。值 ，该比值与抗原抗体间的亲和力成反比并且可据此对克隆亲和力 的高低进行排序。 8.3.3.3.3 多 点 竞 争 唾 菌 体 ELISA (1) 带噬粒的 XLl-blue £：•co"•单克隆接种 Iml 2YT/carb/tet/K〇 7 培养基，37°C ， 200r/min 振摇 2h。 (2) 加卡那霉素（25Mg/m l) ，继续培养至对数中期（ OD55 q= O.6)。 (3) 培养物转移人装有25ml 2Y T /Carb/kan培养基的250m l长颈震荡培养瓶，37°C ， 200r/min振摇过夜。
    ⑷ 用 PEG/N a C l溶液沉淀分离噬菌体，I .Oml P B T 缓冲液重悬沉淀，如前所述测定 O D 值 ，计算噬菌体浓度。 (5) P B T 缓冲液中3 倍连续稀释噬菌体储存液。 (6) 转 移 IOOjLd噬菌体溶液到包被抗原的9 6 孔板中，之后如前封闭板子。 (7) 孵 育 15m in，轻微振摇。 (8) 如前洗板，显色，读板。 (9) 后续步骤中使用亚饱和浓度（ 提供饱和浓度下约5 0 % E L IS A 信号的浓度）的噬 菌体储存液。 (10) 在 9 6 孔 板 的 1 2 孔中个分装135M 亚饱和浓度的噬菌体溶液。 (11) 每孔中加入15沁连续稀释的抗原。使用两倍稀释梯度，理想状态下抗原的起 始浓度应该大于理想IC5。值 的 100倍 。 (12) 孵 育 I .Oh后 转 移 IOOftI 到包被抗原的9 6 孔板中，之后如前封闭板子。 (13) 孵 育 15m in,轻微振摇。 (14) 如前洗板，显色，读板。 (15) 根 据 OD45。的读数作图，显示抗原浓度的影响，根据标准曲线确定IC5。值 。 8.3.3. 4 D N A 测序 前述方案可以对噬菌体颗粒上展示的抗体片段进行分离和功能研究。展示抗体片段 的序列可以通过测定包装在噬菌体颗粒中的编码D N A 序列来推断。可 在 9 6 孔板中进 行高通量D N A 测序。 (1) 带噬粒的单克隆接种9 6 孔 板 中 的 200M1 2Y T /carb/K 0 7 培养基，37°C ，200 r/m in 振摇过夜。 (2) 4000r/m in 离 心 5m in，转移噬菌体上清液到新板中。 (3) 60°C 孵 育 l h ，灭活噬菌体上清液。 (4) 蒸 馏 水 1 : 1 0 稀释噬菌体上清液，取 2^1加 人 下 述 P C R 混 合 液 中 ：19. 7ju l蒸馏 水 ，2. 5/zl 10XPCR 缓冲液，0. 25jlJ 100m m ol/L dN T P ,每种 PCR 引物 0. 25/zl 以及 0. 5yl 的 Am plitaq D N A 聚合酶。引物是扩增D N A 的测序引物。 P C R 反应混合液也可预先配 制分装到9 6 孔 P C R 板中进行高通量测序。 (5) PCR 扩增程序：95°C ，5m in ;(94°C ，30s，55°C ，30s，72°C ，60s)25 个 循 环 ；72°C ， 7m in ，4°C储存。 (6) 在 T A E /琼脂糖凝胶上检测部分反应，取 样 3. O/ u l进行电泳分析。 (7) 96 孔 PCR 板每孔分装 2/^1 PCR clean up m ix 。 (8) 每孔中再加人5/ul P C R 产 物 ，仔细混勻。 (9) 37°C 孵育 15m in ，然后 80°C 孵育 15m in，4°C 保存。 ( 1 0 ) 将制备样品用 Big-Dye Term inator Sequencing Reactions 测 序 （PE Biosysterns， Foster C ity , C A )。 8 . 3 . 3 . 5 蛋 白 质 纯 化 在重链和噬菌体衣壳蛋白基因间的融合点插人一个终止密码子即可以将噬菌体展示
    噬粒转化成一个F ab蛋白的表达载体。使用琥珀终止密码子(T A G )最 方 便 ，在一个琥珀 抑制子宿主，如大肠杆菌X L l-W ue中 F ab 仍然可以在噬菌体中表达，或者它可以在—个 非抑制子菌株中表达F a b 的游离蛋白质。原 则 上 讲 可 以 选 用 任 何 方 便 操 作 的 c〇 Zf表 达菌株，但我们使用了一个蛋白酶缺陷的菌株34B8 。下述方案是为F a b 蛋白的表达和纯 化而设计，方案中载体受碱性磷酸酶启动子的调控，而该启动子在培养基中憐酸盐耗竭时 被激活。 ⑴ 带 表 达 载 体 的 £. co“ 34B8 单克隆接种25ml 2Y T /ca rb 培养基。 (2) 37°C ，200r/m in 振摇过夜。 (3) 5m l培 养 物 接 种 500m l完 全 C.R.A .P 培 养 基 ，其 中 添 加 50Mg/m l 的羧苄青 霉素。 (4) 37°C ，200r/m in 振摇 18〜24h 。 (5) 4°C ，5000r/m in (5000g )离心 15m in，转头 Sorvall GS-3 型 。 (6) 弃上清液，沉淀一70°C 保存。 (7) 50m l重悬缓冲液中重悬沉淀。 (8) 用 T -50 U ltra-T u rra x 勻楽器在冰上11 000r/m in、5m in 匀浆培养物。 (9) 用 M -IlO Y 微射流乳化处理器（ M icrofluidics， N ew ton， M A ) ，6000psi 乳化样品 两次。 (10) 4°C ，15 000r/m in (27 OOOg)离心 60min 除去细胞碎片，转头 Sorvall SS-34 型 ， 之 后 Q.45|Ltm微孔滤膜过滤。 (11) PBS平衡蛋白A 琼脂糖树脂。 (12) 在蛋白质A 琼脂糖树脂中上样两次。 (13) PBS清洗树脂直至280n m 处光吸收值小至可以忽略不计为止。 (14) 1/2树脂体积的0. lm o l/L 乙酸洗脱F a b 蛋白。 (15) pH 8. 0 的 I .Omol/L T r is 碱中和树脂的酸性

    来源：丁香实验

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