牛乳中细菌的检查

实验六十二 牛乳中细菌的检查

　　一、目的要求

　　1．了解牛乳的细菌学检查方法——显微镜直接计数法和标准平板计数法。

　　2．学习牛乳的巴斯德消毒法。

　　二、基本原理

　　从健康母牛体内刚挤出的牛乳，含有少量的正常起始微生物。但将牛乳装入未消毒的器具和在分装、运输过程中，会被很多其他微生物甚至致病菌污染，而且牛乳含有丰富的营养物质（碳水化合物、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素等），在其中的微生物，会很快生长繁殖，因此，一份牛乳样品的细菌含量可反映母牛的健康状况和牛乳生产与保藏的条件。显微镜直接计数法适用于含有大量细菌的牛乳，生牛乳可用此法检查。如果显微镜下观察，每个视野只有1—3个细菌左右，此牛乳即为上等牛乳；如果牛乳中有很多长链链球菌和白细胞，通常是来自患乳房炎的母牛；若一个视野中有很多不同的细菌，则往往说明是使用了脏器具保存的牛乳（如图ⅩⅤ-1）。由于此法不够敏感，一般不作为消毒牛乳的卫生检查。

　　标准平板计数法是广泛用于牛乳微生物计数的常规方法，此法比较敏感，牛乳中含少量细菌时，能得出比较正确的结果。我国消毒牛乳的卫生标准是用标准平板计数法检查，每毫升细菌总数＜30000。

　　三、器材

　　生牛乳10ml，灭菌水，肉膏蛋白胨琼脂；

　　灭菌培养皿，1ml与10ml灭菌吸管，灭菌试管，10μl微量吸液器与吸嘴各一个，载玻片，美蓝染液（Levowitz-Weber染料，配法见附录I）缶；

　　显微镜，水浴锅，试管架，吸水纸等。

　　四、操作步骤

　　1．显微镜直接计数（1）在白纸上画出1cm² 的方块，然后将玻片放在纸上。

　　（2）用10μl的微量吸液器吸取混匀了的生牛乳样品，放在玻片 1cm² 区域的中央。

　　（3）用接种针将牛乳涂匀，并涂满1cm² 的范围。

　　（4）使涂片于空气中慢慢干燥。将铁丝试管架放在沸水浴中，然后置已干燥的涂片于试管架上，用蒸汽热固定5分钟，待干。

　　（5）浸于美蓝染液缶内染色2分钟。

　　（6）取出玻片，用吸水纸吸去多余的染料，晾干。（7）再用水缓缓冲洗，晾干。

　　（8）油镜下观察细菌数，共数30—50个视野。

　　（9）计算

　　每毫升的细菌总数=平均每视野的细菌数×500000

　　因为：

　　一般油镜的视野直径为 0．16mm，

　　一个视野的面积=0．08² ×3．1416=0．02mm² ，

　　化成cm² ，视野面积=0．02×0．01=0．0002cm² ，

　　1cm² 的视野数=1．0÷0．0002=5000，

　　又因每1cm² 的牛乳量为0．01ml，即1/100ml，

　　则每一视野的牛乳量=1/100×1/5 000=1/500 000ml

　　所以，一个视野中的1个细菌就代表1ml牛乳中有 500000个细菌。因此

　　1ml牛乳中的细菌数=一个视野的细菌数×500000= 50个视野的细菌数÷50×500000

　　2．巴斯德法消毒牛乳(1)将水浴锅的温度调节到63℃。

　　(2)将生牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布。(3)用灭菌的10ml吸管吸取5ml生牛乳样品放入灭菌试管内，然后将试管放入调好温度的水浴锅中（水面要超过牛乳的表面）。

　　(4)保持30分钟，并不时摇动。

　　(5)一到30分钟，立刻取出试管，用流动的自来水冲试管外壁，使其中的牛乳迅速冷却。

　　3．标准平板计数法

　　(1)将巴斯德消毒牛乳样品充分摇匀，按实验五十九中池水等的稀释法进行稀释，使稀释度为10^-2 、10^-3 和10^-4

　　(2)用1ml灭菌吸管从最大稀释度开始各取1ml注入已标明样品和稀释度的空白培养皿内。

　　(3)各培养皿倾注约15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂，立即放桌上摇匀。

　　(4)凝固后倒置于37℃下，培养24小时。

　　(5)选择长有30—300个菌落的平板计数，并计算1ml牛乳中的细菌总数。

　　(6)生牛乳样品的检查同上法，但稀释度为10^-3 、10^-4 和10^-5 。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　(1)显微镜直接计数法

　　平均每视野的菌数是多少？

　　每毫升生牛乳的细菌总数是多少？

　　(2)标准平板计数法

　　2．思考题

　　（1）你所检查的巴斯德消毒牛乳，细菌总数是否合乎卫生标准？

　　（2）你所检查的生牛乳在显微镜视野下观察到的情况，对照图ⅩⅤ-1是属于哪一种情况？