细菌形态检查法

细菌形态学是研究细菌的一个重要方面，了解细菌的形态和结构对研究细菌的生理活动、致病性和免疫性，以及鉴别细菌、诊断疾病和防治细菌性感染等均有重要的理论和实际意义。由于细菌个体微小，常以微米(μm)为测量单位，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜放大后才能观察。

根据不同的研究目的和要求，可分别选择普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。另外，由于细菌呈半透明状，要想更清楚地观察其大小和形态，需要进行染色。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。

　　一、不染色标本检查法

不染色标本主要用于检查活菌的动力及运动状况。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。

梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。常用方法有压滴法或悬滴法，置于普通光学显微镜或暗视野显微镜下观察。

1. 压滴法　取菌液一滴，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。这是观察细菌动力的一种简便方法。

2. 悬滴法　取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一个环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。

有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。

3. 暗视野荧光法　由于细菌微小而且半透明，不染色时在普通显微镜下不易看清楚，如使显微镜视野变暗，使菌体发亮，则更容易观察。

　　二、染色标本检查法

细菌个体微小呈半透明状，经染色后才能观察的较清楚。通过对标本染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。

实验室所用的染液都是苯的衍生物，如结晶紫、美蓝、孔雀绿等，是人工合成的染料，它们带色基团与染料分子中含有的不饱和双键有关，含双键的部位的化学性质极不稳定，所以容易吸收光线而显色。

而细菌的等电点比较低，一般在pH2～5之间，如果在中性、碱性或弱酸性溶液中，整个菌体带的是负电荷，容易被碱性染料染上色，这些染料对菌体的核蛋白或细胞壁的成分有特别的亲和性。

常用的染色法有单染法和复染法两种：

①单染法：只用一种染料染色，可观察细菌的形态、大小和排列情况，但不能用于细菌的鉴别。操作过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检。

②复染法：用两种或两种以上的染料染色，可将细菌染成不同的颜色，除可以观察细菌的形态外还能显示出细菌的特殊结构，在细菌的鉴别上有一定的意义。常用的有：

1． 革兰染色法　细菌的革兰染色是最常用的鉴别染色法，由丹麦细菌学家革兰于1884年创建，根据其染色结果将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
操作过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检。

染色具体方法为：初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗。媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗。脱色：连续滴加95％乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。复染：加番红染色1分钟，水洗。

2． 芽孢染色

（1）原理： 细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。

（2）操作：

①用枯草杆菌涂片、干燥、固定。

②在涂菌处滴加5％的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾5～6 min。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗

③0.5％番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。

3． 荚膜染色

（1）原理： 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。

操作：

①涂片，晾干。

②用Tyier氏醋酸结晶紫溶液染色2分钟，再用20%硫酸铜溶液洗涤，水洗，用滤纸吸干、干燥。

③镜检：荚膜染成浅红色，细胞呈紫红色

4． 鞭毛染色法

（1）原理： 细菌鞭毛直径为10~12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。

鞭毛染色的方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动

（2）操作：染色液配制如下。

甲液：①明矾饱和水溶液 2ml；5% 石炭酸水溶液 5ml；20%鞣酸水溶液 2ml；②碱性复红水溶液 1ml。

染色前①液与②液混合后，过滤使用。

乙液：美蓝0.1g，硼砂1g，蒸馏水溶解，定容至100ml。

染色：将制备的涂片自然干燥后，滴加甲液染色3分钟，细小流水洗去染液，用乙液复染0.5~1min，细小流水洗去染液，自然干燥。

镜检：菌体呈蓝色，鞭毛呈红色。

5． 抗酸染色法

（1）原理：分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，主要是分枝菌酸，一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色。这种针对分枝杆菌的特殊的染色法称为齐尼（Zieh-Neelsen）抗酸染色法。

（2）操作：

①结核病人痰涂片，干燥、固定。

②滴加数滴石炭酸复红染液，酒精灯外焰上方微微加温至冒蒸汽时，维持3~5min，勿煮沸、烧干，染液要干时随即添加。小心水洗洗净染液。

③滴加3%盐酸酒精数滴，脱色半分钟至1min，水洗。

④滴加碱性美兰复染0.5～1min，水洗，晾干。

⑤油镜镜检：分枝杆菌呈红色，细长稍弯曲。而其他杂菌和细胞均呈蓝色。

细菌的染色尚有多种方法，如异染颗粒染色法可用于观察细菌中的异染颗粒；Fontana镀银染色法可用于螺旋体的染色检查；Giimenza染色检查立克次体等等。