细菌生化反应检查

一、细菌生化反应常用培养基的制备
 

1.  蛋白胨水
 

成分：蛋白胨1.0 g、氯化钠0.5 g、蒸馏水100 ml。
 

将上述成分加热溶解后校正pH7.6，分装试管，15磅15 min高压灭菌备用。常用于制备糖发酵培养基或用于检查细菌的靛基质产生试验等。
 

2.  糖发酵管
 

成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麦芽糖等糖，溴甲酚紫(B.C.P)、溴麝香草酚兰(B.T.B)或酚红(P.R)等指示剂。
 

在蛋白胨水中加入某种糖(0.5～1%)和指示剂，分装于带一倒立小管的小试管中(图2-5)，15磅20 min高压灭菌后备用。常用于糖发酵试验。
 

3. 葡萄糖蛋白胨水
 

成分：蛋白胨 　　　　0.5 g

葡萄糖 　　　　0.5 g

磷酸氢二钾 　　0.5 g

蒸馏水 　　　　100 ml
 

上述成分混合溶化后校正pH至7.0，分装试管，10磅20 min高压灭菌备用。用于V-P试验和甲基红试验。
 

4.  枸橼酸盐培养基
 

成分：枸橼酸钠 　　　　　　　　　0.2g

硫酸镁 　　　　　　　　　　0.02g

磷酸二氢铵 　　　　　　　　0.1 g

磷酸氢二钾 　　　　　　　　0.1 g

氯化钠 　　　　　　　　　　0.5 g

琼脂(经流水连续彻底漂洗) 　2.0 g

蒸馏水 　　　　　　　　　　100 ml

B.T.B酒精溶液(0.5%) 　　　1.6 ml
 

加热溶化各种成分后校正pH至6.8，再加入0.5%B.T.B乙醇溶液混匀，分装试管，8磅15 min高压灭菌，趁热取出置成斜面。 用于枸橼酸盐利用试验。
 

5.  醋酸铅培养基
 

成分：普通琼脂培养基　　　 100 ml

硫代硫酸钠 　　　　　0.25 g

醋酸铅溶液(10%) 　　1 ml
 

先溶化普通琼脂培养基，然后加入硫代硫酸钠，校正pH为7.2，煮沸过滤，10磅20 min高压灭菌，取出后无菌操作加入已灭菌的10%醋酸铅溶液1 ml，混匀后装于小试管，直立凝固后备用。用于检测硫化氢的产生。
 

6.  尿素培养基
 

成分：蛋白胨 　　　　　　　　0.1 g

氯化钠 　　　　　　　　0.5 g

磷酸二氢钾 　　　　　　0.2 g

琼脂 　　　　　　　　　2.0 g

蒸馏水 　　　　　　　　100 ml

酚红溶液(0.6％) 　 　　0.2 ml

葡萄糖溶液(10％) 　　　0.1 ml

尿素(20％) 　　　　　　1 ml
 

在蒸馏水内加热溶化蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾和琼脂，校正pH7.4，过滤后加入0.6%酚红溶液混匀，8磅15 min高压灭菌，取出待冷至60℃，加入灭菌的10%葡萄糖溶液和20%尿素，分装于小试管内，凝成斜面备用。用于尿素分解试验。
 

二、细菌生化反应检查
 

1.  糖发酵(Fermentation of sugars)
 

将细菌接种于糖发酵管中，37℃培养18～24 h后观察结果。必要时可培养更长时间后再判定结果。
 

细菌如分解糖时，则产酸，使指示剂变色(一般记录符号是"十")；有些细菌在分解糖的同时还产生气体，则倒立小管中有气泡出现(记录符号为"⊕")；如细菌不分解该糖时，指示剂不变色，不见培养液混浊(记录符号为"―")。
 

2.  IMViC 包括下述四种试验
 

（1） 靛基质产生(Production of indole)
 

将细菌接种于蛋白胨水中，37℃培养18～24 h。有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不能直接查见，此时滴加数滴靛基质试剂(Kovacs试剂)于培养基的液面上，其接触面呈玫瑰红色者为阳性，仍呈黄色者为阴性，若颜色不明显，可再加4～5滴乙醚，振荡试管使乙醚分散于液体中，若培养液中有靛基质存在，就可以被提取至乙醚层中，颜色反应较为明显。
 

(注)Kofacs试剂：取对二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylaminobenzaldehyde)4g，加95%酒精380 ml，浓盐酸80 ml即成。
 

（2） 甲基红试验(Methyl red test)
 

将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养48 h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸多，pH值低，故呈红色，为阳性。而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。
 

注：甲基红试剂：取甲基红0.04 g，溶于60%的酒精100 ml中。该试剂酸性时呈红色，碱性时呈黄色。
 

（3） V-P试验(Voges-Proskauer test)
 

将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养48h后，再向培养基中加入等量的40%氢氧化钾溶液(含有0.3%肌酸)。产气杆菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸又被缩合成乙酰甲基甲醇，后者遇碱被空气中氧氧化，生成二乙酰，二乙酰又和培养基中的胍基化合物发生反应，生成红色化合物，培养基变红色，是为V-P试验阳性，其他细菌不能生成乙酰甲基甲醇，培养基不变色，为阴性。
 

（4） 枸橼酸盐利用试验(Utilization of citrate)
 

将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37℃培养48 h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培养基变为碱性，培养基中的指示剂由淡绿色转为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分解枸橼酸盐，培养基颜色不变，为阴性。
 

3.  硫化氢产生试验(Production of H2S)
 

将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，37℃培养24 h后观察结果。有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色无变化，则为阴性。
 

4.  尿素分解试验(Splitting of urea)
 

将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养18～24 h。变形杆菌能迅速(2～4 h)分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色，是为阳性反应。
 

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