抗原结合到抗体-微珠基质层析柱上

为了将抗原结合到抗体微珠基质上，最简单方法是将微珠装到一个层析柱内，再将抗原溶液流经层析柱，当抗原流经层析柱时结合到抗体上而被固定，直到洗脱时才洗脱下来。这种方法的效率取决于抗原与固定的抗体之间的接触时间，通过控制流速，可以改变抗原抗体之间的作用时间。

准备工作

开始前，要考虑层析柱的类型和尺寸。一般来说，粗而矮的柱子比细而高的柱子容易获得陡峭的洗脱峰，而且也容易将微珠转移到另一个容器中储存。粗矮层析柱的缺点是当改变洗脱缓冲液时易扰动微珠基质。

溶液和设备

1. PBS

2. 简单的层析装置

操作步骤

1. 将抗体微珠转移到一个合适的层析柱中，用20倍柱床体积的PBS洗脱。

2. 将抗原溶液加到层析柱中，让溶液缓慢地（约1ml/h每毫升柱床体积），可以用蠕动泵控制流速。

3. 用20倍柱床体积的结合缓冲液（即PBS）洗涤层析柱。

此层析柱可用于进一步洗涤或洗脱。

常见问题与解决方法

这种方法最大问题就是某些蛋白可能非特异地结合到层析柱上，这些蛋白在洗脱时可以出现在洗脱液中，从而使纯化效果降低。基质本身和抗体基质复合物具有与待检抗原溶液中蛋白质非特异性结合的表面活性。虽然这些反应较正常的抗原-抗体反应要弱得多，但抗原溶液中如存在大量的非特异性蛋白即会影响层析纯化效果。为了尽可能减少非特异性吸附，可以采取以下几种措施。

首先，如采用各种亲和柱纯化法，保持抗体-微珠基质的体积略高于其结合抗原的饱和水平，使纯化后的抗原溶液中非特异性蛋白的量尽可能降低。捕获一定量的抗原所需抗体-微珠基质的量与流速有关。流速较慢时，柱容量更有效，因为交联的抗体就有更多时间与抗原结合。

第二种方案是降低柱上的非特异性吸附量。许多吸附到基质上的蛋白质是部分或全部变性的蛋白。当制备抗原溶液时，机械性压力应尽可能小，并避免过度与空气接触。另一种较好的方法是将抗原溶液通过一个未与抗体交联的层析柱，此层析柱应与抗体-微珠基质柱体积相同或更大。还有一种引起非特异性结合的因素是小颗粒碎片被阻留在柱基质上。将抗原溶液经过100000′g离心30min，可以去除制品中大多数较大的凝聚物。

第三种降低非特异性吸附的方法是用缓冲液洗涤层析柱以去除非特异性蛋白。任何不干扰抗原抗体反应的缓冲液都可以用于阻止非特异性结合。