抗体、蛋白A或蛋白G微珠层析柱制备技术
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一、制备
1 ．准备工作
应用抗体柱对各种蛋白质进行亲和纯化的最主要特点是在足够温和的条件厂就能将抗原从柱上洗脱下来，并能保持蛋白质的结构和／或功能不改变。连接抗原和抗体的结合键的类型和数量是决定洗脱难易的关键。在制备大规模层析柱用于纯化之前，有必要对所有可利用的抗体进行测试，并从中选择适当的抗体制备亲和层析柱。
建议不应将抗体流经含有微珠的层析柱，因为这样会使抗体形成·个浓度梯度，从析柱1：而的浓度高，而下面的浓度低。为避免这种情况，应将抗体与微珠混合成泥浆状而使其结合。
2 ．所需的溶液、 试剂 和特殊设备
抗体；蛋白A或蛋白G微珠；0.2mol／ml硼酸钠(pH9.0)；二甲基庚二酸(DMP)；PBS；0.2mol／L乙醇胺(pH8.0)；考马斯亮蓝；Laemmli样品缓冲液；摇床。
3 ．操作步骤
(1)将抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合，一般使用的层析柱，每毫升湿的微珠大约可结合2mg的抗体。将抗体与蛋白A／G微珠混合，使其成为一种稀薄的浆状。在10ml溶液总量中大约含lml微珠。轻轻振荡混匀，室温孵育1h。
如前所述，免疫亲和层析柱一般用单抗或经过亲和纯化的多抗制备。可以用不同来源的抗体，包括杂交瘤细胞培养上清液、腹水或纯化的抗体溶液， 由于与蛋白A／G微珠结合，可作为去除贮存缓冲液或交换缓冲液中其他物质的步骤。
如果需知道与微珠结合抗体的准确浓度，在与微珠结合之前应对抗体进行纯化。
(2)用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠缓冲液(pH9.0)洗涤微珠2次，以3000g离心5min，或10 000g离心30s。
(3)用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠，并取出相当于10u1微珠的混悬液。加足量的DMP(固体)至终浓度为20retool／L。
如用DMP交联，应为pH 8.3以上。
(4)轻轻混匀，室温孵育30min，取出相当于10txl已偶联的微珠。
(5)用0.2mol／L乙醇胺洗涤微珠1次，以终止反应。然后用0.2mol／L悬微珠，室温孵育2h，轻轻混匀。
(6)再次洗涤后，用含0.01％硫柳汞的PBS重悬微珠。
(7)检测微珠样品与抗体结合前后的结合效率，将样品分别加入Laemmli样品缓冲液中煮沸。分别取出相当于1／Il和9btl的两种样品，在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，用考马斯亮蓝染色。结合前样品呈现重链区带(分子质量为55kDa)而结合后样品则无，表明交连成功
亲和层析柱在含硫柳汞缓冲液中置4C可保存1年以上。制备好的微珠即可用于抗原的免疫亲和纯化。
蛋白A／蛋白G微珠—抗体层析柱是用于抗原的亲和纯化最为通用的粒柱基质之一(Gersten和Marchalonisl978，Schneideretal.1982，SimanisandLanel985)。此类层析柱容易制备，由于抗体分子是通过Fc功能区与基质结合，抗原结合位点的确切定向可与抗原最大限度地发生作用。以下介绍的是设计用于蛋白质抗原的纯化，但类似的方案也适用于其他任何抗原。
抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力，可以选用蛋白A或蛋白G微珠。一般推荐将蛋白A用于与小鼠单抗IsG2a、IgG2b和IgG3亚类连接，而将蛋白G用于IsGl。蛋白G用于与大鼠单抗连接，对于各种多克隆抗体，蛋白A适用于家兔、人、猪、脉鼠、狗或猫的样本，而蛋白G适用于小鼠、大鼠、绵羊、马、驴、牛或山羊的多克隆抗体。
一旦抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合后，再通过双功能连接剂将其交叉连接到基质上。可以使用任何双功能连接剂，但大多数人使用二甲基庚二酸酯(DMP)，因其价廉而且易于掌握。DMP的2种结合基团相同，都能与游离的氨基结合、由于碳分子骨架有很大的韧性，大多数抗体／蛋白A或蛋白G组合在合适的距离内存在反应位点，故能有效地结合。偶然不能有效结合，可以使用带有不同长度碳原子空隙的其他交连剂。
二、 常见问题
当抗体的游离氨基是与抗原结合的关键部位时，应用这种方法可能出现某些问题。此时，交连剂经常与抗原结合部位结合而阻断其与靶抗原的相互作用。
当偶联是成功的，并且在事先的工作中亦证明该抗体用于免疫沉淀是有效的，据此可以推断是由于偶联过程破坏了抗体与抗原结合的能力。出现这种情况时，可采用两种途径解决：使用较少量的交连剂以减少与抗原识别位点的作用，或者使用不依靠-NH2基团的其他双功能交连剂。上述方法可以先用小量的抗体与蛋白A或蛋白G结合进行试验，操作过程类似于下面将要介绍的方法。
值得注意的是，在使用此类亲和层析柱时，柱内没有与抗体交连的少量蛋白A和蛋白G分子与抗原制品中的无关抗体发生作用。因此，当此类层析柱用于纯化来自哺乳类动物抗原时，也可以纯化抗原制品中出现的抗体。这些问题是由于在纯化的抗原制品中混杂有重链和轻链多肽造成的。开始时应用不含有抗体的抗原制品进行纯化，或者是在抗原纯化之前或纯化后通过蛋白A或蛋白G层析柱去除制品中混杂的抗体，可以避免这类问题的发生。
有时结合反应不完全，这些可发生在由于DMP 试剂 贮存不当，或者是 抗体 制品中含有其他带有游离氨基的化合物。在检测结合效果时，上述步骤如发现少量的重链即说明有结合不完全，见步骤(7)。当出现这种情况时，先用100mmol／L甘氨酸(pH2.8)洗涤结合的微珠，可以去除任何非共价结合于蛋白A或蛋白G分子上的 抗体 。如果问题很严重，整个结合反应必须在设置对照的情况下重复进行，以发现问题出现的步骤。根据我们的经验，问题通常出现在使用贮存不当的DMP，或由于洗涤和结合 缓冲液 的pH值太低。
1 ．准备工作
应用抗体柱对各种蛋白质进行亲和纯化的最主要特点是在足够温和的条件厂就能将抗原从柱上洗脱下来，并能保持蛋白质的结构和／或功能不改变。连接抗原和抗体的结合键的类型和数量是决定洗脱难易的关键。在制备大规模层析柱用于纯化之前，有必要对所有可利用的抗体进行测试，并从中选择适当的抗体制备亲和层析柱。
建议不应将抗体流经含有微珠的层析柱，因为这样会使抗体形成·个浓度梯度，从析柱1：而的浓度高，而下面的浓度低。为避免这种情况，应将抗体与微珠混合成泥浆状而使其结合。
2 ．所需的溶液、 试剂 和特殊设备
抗体；蛋白A或蛋白G微珠；0.2mol／ml硼酸钠(pH9.0)；二甲基庚二酸(DMP)；PBS；0.2mol／L乙醇胺(pH8.0)；考马斯亮蓝；Laemmli样品缓冲液；摇床。
3 ．操作步骤
(1)将抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合，一般使用的层析柱，每毫升湿的微珠大约可结合2mg的抗体。将抗体与蛋白A／G微珠混合，使其成为一种稀薄的浆状。在10ml溶液总量中大约含lml微珠。轻轻振荡混匀，室温孵育1h。
如前所述，免疫亲和层析柱一般用单抗或经过亲和纯化的多抗制备。可以用不同来源的抗体，包括杂交瘤细胞培养上清液、腹水或纯化的抗体溶液， 由于与蛋白A／G微珠结合，可作为去除贮存缓冲液或交换缓冲液中其他物质的步骤。
如果需知道与微珠结合抗体的准确浓度，在与微珠结合之前应对抗体进行纯化。
(2)用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠缓冲液(pH9.0)洗涤微珠2次，以3000g离心5min，或10 000g离心30s。
(3)用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠，并取出相当于10u1微珠的混悬液。加足量的DMP(固体)至终浓度为20retool／L。
如用DMP交联，应为pH 8.3以上。
(4)轻轻混匀，室温孵育30min，取出相当于10txl已偶联的微珠。
(5)用0.2mol／L乙醇胺洗涤微珠1次，以终止反应。然后用0.2mol／L悬微珠，室温孵育2h，轻轻混匀。
(6)再次洗涤后，用含0.01％硫柳汞的PBS重悬微珠。
(7)检测微珠样品与抗体结合前后的结合效率，将样品分别加入Laemmli样品缓冲液中煮沸。分别取出相当于1／Il和9btl的两种样品，在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，用考马斯亮蓝染色。结合前样品呈现重链区带(分子质量为55kDa)而结合后样品则无，表明交连成功
亲和层析柱在含硫柳汞缓冲液中置4C可保存1年以上。制备好的微珠即可用于抗原的免疫亲和纯化。
蛋白A／蛋白G微珠—抗体层析柱是用于抗原的亲和纯化最为通用的粒柱基质之一(Gersten和Marchalonisl978，Schneideretal.1982，SimanisandLanel985)。此类层析柱容易制备，由于抗体分子是通过Fc功能区与基质结合，抗原结合位点的确切定向可与抗原最大限度地发生作用。以下介绍的是设计用于蛋白质抗原的纯化，但类似的方案也适用于其他任何抗原。
抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力，可以选用蛋白A或蛋白G微珠。一般推荐将蛋白A用于与小鼠单抗IsG2a、IgG2b和IgG3亚类连接，而将蛋白G用于IsGl。蛋白G用于与大鼠单抗连接，对于各种多克隆抗体，蛋白A适用于家兔、人、猪、脉鼠、狗或猫的样本，而蛋白G适用于小鼠、大鼠、绵羊、马、驴、牛或山羊的多克隆抗体。
一旦抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合后，再通过双功能连接剂将其交叉连接到基质上。可以使用任何双功能连接剂，但大多数人使用二甲基庚二酸酯(DMP)，因其价廉而且易于掌握。DMP的2种结合基团相同，都能与游离的氨基结合、由于碳分子骨架有很大的韧性，大多数抗体／蛋白A或蛋白G组合在合适的距离内存在反应位点，故能有效地结合。偶然不能有效结合，可以使用带有不同长度碳原子空隙的其他交连剂。
二、 常见问题
当抗体的游离氨基是与抗原结合的关键部位时，应用这种方法可能出现某些问题。此时，交连剂经常与抗原结合部位结合而阻断其与靶抗原的相互作用。
当偶联是成功的，并且在事先的工作中亦证明该抗体用于免疫沉淀是有效的，据此可以推断是由于偶联过程破坏了抗体与抗原结合的能力。出现这种情况时，可采用两种途径解决：使用较少量的交连剂以减少与抗原识别位点的作用，或者使用不依靠-NH2基团的其他双功能交连剂。上述方法可以先用小量的抗体与蛋白A或蛋白G结合进行试验，操作过程类似于下面将要介绍的方法。
值得注意的是，在使用此类亲和层析柱时，柱内没有与抗体交连的少量蛋白A和蛋白G分子与抗原制品中的无关抗体发生作用。因此，当此类层析柱用于纯化来自哺乳类动物抗原时，也可以纯化抗原制品中出现的抗体。这些问题是由于在纯化的抗原制品中混杂有重链和轻链多肽造成的。开始时应用不含有抗体的抗原制品进行纯化，或者是在抗原纯化之前或纯化后通过蛋白A或蛋白G层析柱去除制品中混杂的抗体，可以避免这类问题的发生。
有时结合反应不完全，这些可发生在由于DMP 试剂 贮存不当，或者是 抗体 制品中含有其他带有游离氨基的化合物。在检测结合效果时，上述步骤如发现少量的重链即说明有结合不完全，见步骤(7)。当出现这种情况时，先用100mmol／L甘氨酸(pH2.8)洗涤结合的微珠，可以去除任何非共价结合于蛋白A或蛋白G分子上的 抗体 。如果问题很严重，整个结合反应必须在设置对照的情况下重复进行，以发现问题出现的步骤。根据我们的经验，问题通常出现在使用贮存不当的DMP，或由于洗涤和结合 缓冲液 的pH值太低。
