重组G蛋白偶联受体的纯化实验

一、引言

天然的整合膜蛋白的量并不充足。因此对其的结构测定和功能分析需要:①重组膜蛋白的生产系统;②能分离得到有活性的膜蛋白（而不是没有功能、折叠错误的膜蛋白）的纯化策略。表达并纯化原核和真核的膜蛋白在文献中都有报道。读者可以参考如Grisshammer 和Tate(1995;2003) 及Grisshammer和Buchanan(2006) 的文献，也可以查询本书的第35章。GPCR作为真核生物的整合膜蛋白，参与细胞间的交流和感觉信号转导[见Gether和Kobilka(l998)]。本章是对GPCR 的专题讨论。

对于如GPCR 的整合膜蛋白，本章不涉及其表达的所有可能策略细节，但是这里总结了一些关键点。①目前还没有一个通用的可高效表达功能受体的策略。一些GPCR能高水平的积聚在细胞膜上，而其他某些相关的受体却很难检测到。而且虽然推测具有相似性，但在特定的表达宿主中的不同的 GPCR表现却十分不同。所以GPCR 的重组表达仍然是一个反复实验的过程。例如，在表达对比研究中，已经完成的尝试包括使用甲醇营养型毕赤酵母(Andreetal.,2006)、杆状病毒昆虫细胞系统(Akermounetal_，2005) 和西门利克森林病毒系统（Hassaineetal.,2006)等。目前已经有了GPCR 在常用表达宿主表达的研究总结(Sarranmegnaetal.,2003)。②通常真核宿主似乎能够比原核宿主更好的表达有功能的、嵌膜的 GPCR(Grisshammer，2006)。但有一些例外。例如，已经在大肠杆菌中成功表达了神经降压素受体 NTSl(Grisshammeretal.,1993;Whiteetal.，2004)、M1蕈毒碱乙酰胆碱受体（HulmeandCurtis,1988)、腺苷A2a受体（WeiBandGrisshammer，2002) 和大麻素CB2受体632(Calandraetal.,1997;Yeliseevetal.，2005)。③已经有了很多关于重组表达整合膜蛋白的描述性报道。然而，目前只有少数文献[见 Bonander 等 (2005;2009),Griffith等（2003);Wagner等（2006;2007)]讨论了特定宿主细胞对于膜蛋白过表达的反应机制。

纯化受体从概念上可以分成两步: 第一步用合适的去污剂将受体从膜中提取出来 (增溶）; 第二步使用如常规的亲和标签、与该受体特异结合的配体层析柱、分子排阻色谱和其他方法纯化受体。最重要的是，必须注意选择实验条件以保持膜蛋白在整个纯化过程中处于活性状态。这一点怎么强调也不过分，因为很多 GPCR—旦被去污剂从质膜中提取出来就会变得不稳定。

二、蛋白质增溶的一般注意事项

提取嵌膜受体需要使用去污剂(详见第34章）。去污剂的正确选择对于长时间维持溶解受体的活性状态非常关键。]V-十二烷基子1>麦芽苷（iV-Dodecyl-^^maltoside，DDM) 是温和的非离子型去污剂，通常用于 GPCR 的增溶。添加脂样的胆留醇半琥珀酸酯 (CholesteryIhemisuccimte) 可以提高受体的稳定性。短链的去污剂通常要比长链去污剂作用猛烈，但只要它们不损害要研究的GPCR 的完整性, 也是可以接受的。

溶解的受体必须被看成是去污剂-脂质-受体的复合物，而不是单纯的受体蛋白质。

这意味着溶解后的受体的生化特性，如大小、形状或等电点与单独根据氨基酸序列计算出的结果是不一样的。同样，去污剂-脂质-受体的复合物不能被理所当然的当成是均质的。

因为在增溶过程中脂质与受体一样结合去污剂，因此去污剂和膜的比例会决定受体周围去污剂和脂质结合的量。在纯化的过程中脂质和去污剂的结合量会发生改变。

增溶的过程必须优化，使其能够在维持溶液中特定 GPCR 最稳定的同时得到最高的提取效率。通过放射性配体结合分析和总蛋白质含量测定，可以监测去污剂对加人的膜的系统变异 (systematicvariation) 效应。这需要计算实验的 Bmax 值（nmol 功能性受体/mg 蛋白质) 并将其与纯化的功能性受体的特异性结合的理论值相比较。如果没有可用的功能性检验方法，则可以使用具有良好生化行为的如对称的分子排阻层析谱作为受体完整性的指标。

因为在受体提取前可溶蛋白质已被去除，增溶之前的膜制备过程其实已经包含了一步初始的纯化步骤，目的受体对污染物的比例也会因此提高。实际上在第一步纯化过程中，受体也可从总细胞裂解物中而不是从溶解的细胞膜中富集。

三、蛋白质纯化的一般注意事项

1.去污剂溶液中 GPCR的稳定性

很多GPCR 在去污剂溶液中都不是十分稳定 [除了视紫红质 (rhodopsin)，只要其保持在非信号黑暗状态（DeGrip，1982)]。导致不稳定的一个可能原因也许是 GPCR 结构上固有的柔性，即受体在去污剂溶液中具有多种构象, 而其中的一些构象会使蛋白质聚集。在纯化过程中去除脂质也会引起不稳定。已经有很多方法用于提高 GPCR在去污剂溶液中的稳定性。例如，加入反向激动剂（inverseagonist)/抬抗剂（antagonist) 配体 (Cherezovetal.,2007；Hansonetal.,2008；Jaakolaetal.,2008；Warneetal.,2008)^使受体处于无信号失活状态, 这通常比活性状态更稳定 [见 Kobilka 和 DeUpi(2007)], 如胆甾醇半號 50 酸酯（cholesterylhemisuccinate) 的脂质或脂样物质 (Jaakolaetal.,2008;”TuckerandGrisshammer,1996;WeiBandGrisshammer,2002) 和甘油（TuckerandGrisshammer，1996) 在纯化中会提高受体的稳定性。定点突变也已经用于产生稳定性更高的GPCR(Magnanietal.,2008；Rothetal.,2008；Sarkaretal.,2008；Serrano-Vegaetal.,2008;Shibataetal.,2009), 因而能耐受更大范围的去污剂。

2.一般的亲和层析

去污剂溶液中 GPCR的生化和药理性质可以粗略地分为两类。①由放射性配体结合分析和 G 蛋白核苷酸交换实验 (Whiteetal.,2007) 评价，在优化的缓冲条件下, 能够纯化到活性形式的均质受体被称为功能性受体。②在某些情况下（Kobilka，1995;Whiteetal.，2004)，存在去污剂可溶的却不能结合特异性配体的受体种类。笔者把后一种称为非功能性的、未正确折叠 (至少在受体识别方面) 但仍是去污剂可溶的受体种类。

重组克隆技术使得在给定受体的 N 端或 C 端引入常用的亲和标签变得容易。例如，受体 N 端的 Flag 表位标签可用于 Ml 抗体亲和层析柱 (Kobilka,1995) 或受体 C 端的多聚组氨酸尾用于固定金属亲和层析（immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)(GrisshammerandTucker,1997；Hansonetal.,2008；HulmeandCurtis,1998；Jaakolaetal.,2008；Klaassenetal.,1999；Kobilka,1995；Warneetal.,2003；WeiBandGrisshammer，2002;Yeliseevetal.,2005)。一种识别牛视紫红质 C 端的抗体层析柱（104311-tibody;MoldayandMacKenzie,1983) 可用于一步纯化视紫红质（Oprianetal.,1987;ReevesetaL，1”9) 和 C 端融合了 1D4 表位标签的少肾上腺素能受体 (Chelikanietal.，2006)。

亲和标签的准确位置 (如远离受体的跨膜核心或接近跨膜螺旋) 决定了受体和亲和树脂的结合步骤应该采用批量混合 (inbatch) 或采用柱上 (incolumn) 方式。太接近跨膜核心的亲和标签也许会部分地被受体蛋白周围的去污剂层遮蔽，因此不易接近亲和树脂。

这种情况下长时间混合加载会更有效地捕获受体 (WeiBandGrisshammer,2002)。而亲和标签暴露良好的受体可直接加载到树脂填充的层析柱上，较短的暴露时间就能使纯化标签与亲和树脂结合。批量混合纯化步骤必须手动操作，而层析柱加载可以自动操作 (WhiteetaL，2004)。虽然与蛋白质结合的去污剂的准确含量依赖于各去污剂的性质，但作为一般的指导原则，低临界胶束浓度的去污剂比高临界胶束浓度的去污剂在膜蛋白周围形成更大的去污剂层 [见Bamber等 (2006)]。因此, 与高临界胶束浓度的去污剂相比，低临界胶束浓度去污剂会降低亲和标签与树脂的可接近性。

许多实验室使用 IMAC 作为第一步富集步骤。商品化的树脂类型有 Ni2-NTA 树脂（Ni2+-nitrilotriacetate,Qiagen)、Talon 树脂（Co2+-carboxymethylaspartate，Clontech)和 IDA 树脂 (iminodiacetate，Zn2+,Ni2+，Co2、GEHealthcare)。然而，不同 IMAC 树脂的性质稍有不同 (WeiBandGrisshammer,2002)。例如, 与 Talon 树脂相比，Ni2+-NTA 树脂不仅能更强的结合目标膜蛋白，也会结合更多的污染物。受体的表达水平 (如目标受体和杂质的比例) 决定了第一步纯化的效率。表达量越高, 第一步纯化效率越高。用一步 IMAC 纯化突变的/V 肾上腺素能受体能够达到大于 90% 的纯度（HansonetaL,2008)。

某些情况下，IMAC 树脂结合去污剂增溶受体的能力低于与可溶蛋白质结合的能力 (WeifiandGrisshammer，2002;Whiteetal.，2004)。

纯化的时间和步骤都应该保持到最小值，因为纯化的所有阶段都会引起蛋白质的损失。

3.受体-特异配体亲和层析

用一般的亲和标签富集受体之后，可能需要第二步纯化以分离到纯净、有功能的受体蛋白。这主要是因为：①第一步纯化得到的受体还不够纯, 仍有其他污染物。例如，用 XAaxanthineamineC0ngener，拮抗剂）层析柱纯化腺苷受体可去除其中的一个主要污染物 (WeiBandGriSshammer，2002)。类似的, 用 NT[神经降压肽 (neurotensin)，激动剂] 层析柱 (Whiteetal.，2004) 纯化神经降压肽受体 NTS1 可得到均一物质; 用阿普洛尔 (alprenolol，非选择性, 肾上腺素能受体抬抗剂) 琼脂糖层析柱纯化，肾上腺素能受体。从一般亲和树脂上洗脱的受体可能包含功能性的和非功能性、错误折叠的受体，而后续受体_特异配体亲和层析也能去除非功能性的受体部分。②一个 (或两个连续的) 一般亲和标签步骤能得到几乎纯净的受体，然而却是功能性和非功能性受体的混合物。一般亲和标签不能从错误折叠但仍是去污剂可溶的受体中分辨出正确折叠的受体。受体的错误折叠可能发生在表达宿主中，也会因在去污剂溶液中不稳定而发生。受体-特异配体亲和层析柱能够从错误折叠的受体中分辨出有功能的受体。例如，阿普洛尔层析柱可被用于分离有功能的体-肾上腺素能受体 (Kobilka，1995)。③在粗溶的受体中加入生物素化的肽配体 (PACAP38) 及亲和素树脂，一步纯化方案能够制备高度富集的垂体腺苷酸环化酶促多肤 (pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide，PACAP)。

4.去污剂增溶 GPCR的分析

去污剂增溶的、有功能的受体含量可以通过放射配体结合 (radioligand-binding) 实验确定。理想状态下，放射配体应以较高的亲和力结合受体，并表现缓慢的解离速率，从而在从游离配体分离出配体-受体-去污剂复合物的过程中，能够避免非平衡状态中导致的可能的假象 (artifact) 产生。HUlme(1990) 概述了受体结合研究。对于具有亲水性而不会掺人空的去污剂胶束的标记配体，放射配体结合分析的效果最好。相反, 疏水性的配体会插入空去污剂胶团而导致非特异的高背景信号。

推荐使用氨基黑分析法 (amidoblackassay)(SchaffnerandWeissmann,1973) 检测蛋白质的含量。在去污剂和配体存在的条件下, 许多检测蛋白质含量的方法不准确。氨基黑分析包含一个沉淀步骤用于去除去污剂、配体或其他缓冲成分。需要注意的是，不是所有的蛋白质与染料 (如氨基黑) 有相同的结合力，这意味着如果受体与染料的结合与参比蛋白质 (BSA) 不同，则蛋白质浓度测定也许会有偏差。

从配体结合数据和蛋白质含量分析，可以计算出 Bmax 的实验值 (nmol 功能性受体/mg 蛋白质) 并将其与纯的功能受体特异结合的理论值比较。需要注意的是, 因为不同的氨基酸组成理论值对每个 GPCR 都是特异的。如果实验值与理论 Bmax 值匹配, 则说明纯化到了活性受体。

四、增溶和纯化重组神经降压肽受体 NTS1

NTSl 增溶、纯化和分析的更详细的描述见 White 和 GriSShammer(2007) 的文献，这里主要讨论其要点。NTSl 融合蛋白纯品的获得可通过联合使用 IMAC 层析柱和 NTSl 特异配体层析柱实现。

将 NTSl 与麦芽糖结合蛋白 (mahose-bindingprotem,MBP) 融合可在大肠杆菌中实现具有功能的嵌膜 NTSl 表达（Grisshammeretal.,1993)。表达质粒编码含信号肽序列的 MBP 及其后的受体。在大肠杆菌中前导肽酶去除信号肽后，用于纯化的 NTSl 融合蛋白 MBP-T43NTR-TrxA-H10(NTSl-624) 的序列组成依次为: 成熟的大肠杆菌 MBP(Lys1 到 Thr366)、N 端截断的大鼠神经降压素 I 型受体NTS1(T43NTR，THr43 到 Tyr424)(Tanakaetal.,I”。）、大肠杆菌硫氧还蛋白（TrxA,Ser2 到 AlallM)[TrxA 会增加融合蛋白的表达量，见 Tucker和 Grisshammerd9%)] 和 10 个组氨酸标签（HlO)(GrisshammerandTucker，B97)。表达在低温 (22°C) 中进行，由一个低拷贝表达质粒的弱启动子驱动。

这避免了新生受体链导致的大肠杆菌转位和膜插入机制过载的可能性。在任何给定的时间点蛋白质产量都很少，但 2 天后就能观察到积累的正确折叠的受体。纯化 10 mg 的 NTSl 融合蛋白通常需要 250 g 湿重的大肠杆菌菌体，相当于 50L 的培养规模（Whiteetal.，2004), 这很容易通过发酵实现。

在大肠杆菌中 NTSl 融合蛋白的表达量处于中等水平（即污染物和目的受体的比值高）。因此，需要一个优化的能够有效富集受体融合蛋白的 IMAC 方案。为达到这一目的，在 Ni2-NTA 层析柱纯化中，采用了 10 个组氨酸残基的 C 端标签而不是 6f(GrisshammerandTucker,1997)。Ni2+-NTA 树脂和 10 组氨酸标签受体的紧密结合允许使用含 50 mmol/L 的咪唑的严格洗涤步骤。这个浓度的咪唑去除了结合于 Ni2-NTA 树脂的绝大部分大肠杆菌的污染物，但不会洗脱目的融合蛋白。这一策略不仅可以从粗制的膜中有效的纯化受体，而且也能很好应用于全细胞裂解产物 (GrisshammerandTuck-er，1997)0NiB 缓冲液中的高钠离子浓度和高咪唑浓度会减弱 NT 和 NTSl 的亲和力, 从而会阻碍从 Nia-NTA 层析柱上洗脱下的功能性受体与 NT 层析柱的直接结合。因此须用缓冲液将 NaCl 和咪唑的浓度从 200 mmol/L 稀释到 70 mmol/L，以使功能性的 NTSl 能够结合到 NT 层析柱上。NTSl 和 NT 的结合对 NaCl 敏感，可用高浓度的 NaCl 将受体从 NT 层析柱上有效的洗脱下来(图 36.1)。

1.NTSl 融合蛋白的增溶

(1) 除非另有说明，所有的步骤均在 4°C 或在冰上操作。

(2) 室温下用锤子压碎塑料薄板之间的 250 g 冷冻细胞。将细胞放入 Waring 搅拌器。

(3) 加人 500 mL 冷的 2X 增溶缓冲液 [100 mmol/LTris-HCKpH7.4)、60%(V/V) 甘油、4OOmmol/LNaCl]。运行搅拌器使细胞充分重悬。

(4) 将细胞悬液转人有磁棒的烧杯中。由于搅拌器会将空气引入悬浮液，这一步很难确定体积。因此最终的体积在第 (11) 步调节。

(5) 在搅拌的过程中，加入蛋白酶抑制剂储备液各 ImL(PMSF,70 mg/mL 溶于乙醇; 亮抑酶肽，Img/mL 溶于水; 抑肽素 A,l.4 mg/mL 溶于甲醇)、5 mLImol/LMgCl2(终浓度为 5 mmol/L)、0.6 mLDNaseI 溶液（10 mg/mL,SigmaD-4527)和 50 mL 冷 H20。

(6) 在搅拌的过程中，滴加 100 mLCHAPS,/CHS 储备液 [6%(w/V)(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-l-propanesulfonate)/1.2%(m/V)cholesterylhemisuccinateTrissaltinH20]。CHS 自身不溶于水，需要在 CHAPS 中溶解。

(7) 在搅拌过程中，滴加 100 mLDDM 储备液 [10%(W/V) 水溶十二烷基-1-麦芽糖苷]。

(8) 继续搅拌 15 min。

(9) 超声 33 min(8s/g 细胞），1s 开，2s 关，第 4 级 (Misonix 公司超声波破碎仪，0.5 英寸，平底探头）。保持样品处于冰水浴以避免超声过程中局部加热。这一温和的超声步骤能加强受体的增溶效率。

(10) 每种蛋白酶抑制剂额外各加人 ImL。

(11) 边搅拌边滴加冷的 H2O 至终体积 IL。

(12) 再揽拌样品 30 min。

(13) 超速离心样品 1 h[Beckman45Ti 转子或同等转子，45000r/min(235000 g 于 Fmax)]。

(14) 回收增溶后受体 (上清液中）。

(15) 边搅拌边滴加咪唑储备液 (2moLL, 用 HCl 调节到 pH7.4, 终浓度 50 mmol/L)。0.22pm 滤器过滤样品。此时可用 IMAC 层析柱和神经降压素亲和层析柱从此上清液中纯化受体。

2.固定化金属亲和层析纯化 NTSl 融合蛋白

此纯化可用 AktaPurifier(GEHealthcare) 层析系统的两柱模式在冷室全自动完成，细节详见 White 和 Grisshammer(2007)及 White 等(2004)的文献。纯化仪装备有气体传感器、样品泵 P950、改良的进样阀、一根 100 mL 的 Ni2+-NTA 层析柱、一根 20 mL 的 NT 层析柱和分离组分收集器 Frac950。所有的纯化步骤也可用更简单的设置操作，即先用 IMAC 层析柱纯化，随后将 Ni2+-NTA 层析柱的洗脱液稀释后再上样加载到 NT 层析