DNA重组实验

实验步骤

实验原理

1 双酶切（单位：μL）

管 核酸 buffer ddH₂ O Hind III BamH I

1 15(AKP) 2 0 2 1 

2 10(质粒)2 5 2 1

 37℃酶解3小时

在此体系中，我们用Hind III 和BamH I这两种限制性内切酶来切目的基因，这样会产生两个不同的粘性末端，这时候如果插入目的基因，可以保证目标序列插入的方向并提高效率。

2 酶切产物的纯化和回收

1)

向酶切体系的管中加入60 μl 溶液A（6mol/L NaClO4, 0.03mol/L NaAc，pH 5.2）和 15 μl溶液B(3mol/L NaAC, pH 5.2)，充分混匀。

高盐上样。

2)

将溶液置于离心柱中，静置5min。

这是一个类似于吸附层析的过程。DNA会特异的吸附于硅质的薄膜上，故可以起到分离的效果。

高盐能促进吸附。

3)

8,000 rpm，离心30秒，弃液体。

4)

加入500 μl溶液C(用时一定按照 1：2 的比例加入无水乙醇，混匀后使用)于离心柱中， 8,000 rpm，离心30秒,弃液体。

此步骤是洗涤。

5)

重复步骤4。

再次洗涤。

6)

12,000 rpm，再离心60秒，去残余的乙醇。

将剩余的乙醇尽量完全甩出去。

7)

超净台中凉干。

挥发乙醇。

8)

加入25μl 溶液D(TE) ，500C 保温5min。 

此步骤是解析。
让DNA释放到溶液中，离心的方法可以将DNA纯化。
低盐有利于解吸附。

9)

12,000 rpm离心2min，管底溶液即为所需的DNA。

10)

1％琼脂糖，0.5 x TBE ,5 μl 样品，80V 恒压电泳，检测AKP和载体的相对浓度。

为了使质粒和目标基因浓度比例在1:3到1:10之间，所以先用电泳的方法预先了解一下样品的浓度，然后再连接。 

当质粒与目标基因比例合适时，可以由高的连接率，有效降低自连的发生。另外，酶的浓度过高还会有星号活力。

3连接（单位：μL）

AKP 质粒 buffer ddH2O T4DNA连接酶

 15 2 2 0 1

14℃连接过夜，之后－20℃保存，用于转化受体细胞。

由电泳结果显示，我的质粒切得并不好，所以我用了本组另一名同学的质粒。他的质粒浓度高且纯净，所以用2μL就足够。我总共用20μL体系。

4目的基因转化及筛选

将连接好的质粒转入菌NovaBlue中（两个阴性对照），具体方法见试验一报告。

培养NovaBlue要用1/1000的Tet。

   在预制的LB琼脂平板上，加40μl Xgal（20mg/mL ）和40μl IPTG（20mg/mL）溶液，均匀涂布于琼脂平板表面。

   将复苏后的菌液离心，抽出0.8mL上清，剩余的细胞和上清液混匀，取100μl细胞悬液涂布在上述含Tet,Carb抗生素的培养皿中，平板向上静置30min,倒置培养过夜。

因为NovaBlue中含有f’质粒，它是抗Tet的，加入1/1000的Tet可以提供一个竞争压力，才能使这个质粒不丢失，这个菌株才能在有Tet的培养基中生长。 

NovaBlue编码Tet诱发的promoter的RNA polymerase，培养基中有Tet,而petBlue中的Tet诱发的promoter可以按其启动方向转录出lacZα肽，NovaBlue中又含有lacω肽。这样就可以用互补α筛选出重组菌。 

Xgal和IPTG较贵，只涂在培养基的表面，可以节省成本。 

之所以将复苏后的菌液离心，抽出0.8mL上清，剩余的细胞和上清液混匀，取100μl细胞悬液涂布是因为重组成功的菌数量是很少的，这样可以增加平板上的菌的数量，有利于筛选出我们要的重组子。

5重组子的筛选

1）

质粒DNA提取

 方法同实验二

 挑取重组子是要挑取蓝斑周围的白斑

很多白斑的产生都是因为Xgal或IPTG之一没有涂均匀，而蓝斑周围的白斑很可能是因为重组子造成的，这样是假阳性的几率会比较小。

2）

酶切（37℃，1h） 

酶切结果可以分析是否是真阳性。

 具体分析见电泳结果分析

3）

电泳分析重组质粒

 1％琼脂糖，0.5xTBE, 80V恒压电泳

 未酶切质粒（用未重组的质粒作为Marker） 

3μl质粒 ＋ 0.5 μl 10 x loading 0.5 μl SYBR 

酶切质粒（用标准DNA分子作为Marker）  

8 μl质粒 ＋ 1 μl 10 x loading 1 μl SYBR

电泳跑两排，前面的跑切过质粒，后面的跑没切过的质粒。因为没有被切过质粒分子量大，跑得慢，所以这样就不会追上前面的，这样可以电泳更长的时间，增大分辨率。

4）

重组子转化表达菌株 

取电泳检验过得真阳性菌提出的质粒做感受态（菌用DE3placI），复苏后涂平板，平板上要加葡萄糖和Cam,Carb。

 overnight

葡萄糖可以抑制lacI本底表达。 

DE3placI是含有T7RNA polymerase，而petBlue含有T7promoter，这个方向的转录可以才可以按正确的顺序表达目的蛋白。

 DE3placI有Cam的抗性基因。Cam既可以稳定petBlue的f1区，也可以竞争抑制杂菌。