DNA 体外重组，又称基因克隆，是基因操作中最基本的技术，也是分子生物学的核心技术。

DNA 体外重组包括：

1. 欲进行重组的 DNA 片段（常称为目的 DNA) 的获取；
   

2. 载体的选择及准备；

3. 目的 DNA 片段与载体的连接；

4. 重组 DNA 导入宿主细胞；

5. 含重组 DNA 宿主细胞的克隆化及鉴定。

DNA 体外重组 ( DNA recombination in vitro) 的基本原理是将 2 个或 2 个以上 DNA 分子通过体外连接、体内克隆扩增的方法组成一个新 DNA 分子的过程。

DNA 体外重组可用于构建基因文库、外源表达基因、基因改造即基因定点诱变等。

一、基因组 DNA 的制备

（一）从哺乳动物组织中提取基因组 DNA

1. 将新鲜组织剪成小块并立即置于液氮中冻存；

2. 将 200 mg～1 g 的组织用预冷的研钵研碎，或用锤子将其捣为细粉末，每 100 mg 组织用 1.2 ml 消化缓冲液悬浮，然后于 50℃ 摇荡温育 12～18 h；

3. 用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700×g，离心 10 min。如果样品溶解得不好，再加 1 体积不含蛋白酶 K 的消化缓冲液，重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质，重复抽提一次，将上层 (水溶液) 转移至一个新离心管中；

4. 加入 1 / 2 体积 7.5mol/L 乙酸铵和 2 倍体积 100% 乙醇，12 000rpm 离心 2 min；

5. 用 70% 乙醇洗涤，晾干，沉淀用 TE 缓冲液或无菌双蒸水重新溶解, 使终浓度在约 1 mg/ml。注: 加入 0.1% 的 SDS 和 1? 滋 g/ml 无 DNA 酶的 RNA 酶，37℃ 温育 1 h，以除去残留的 RNA。

6. 重复步骤 4、5。1 g 细胞大约能提取到 2 mg DNA。

（二）从植物组织中提取基因组 DNA

1. 在所需量的 CTAB 抽提液中加入 2 -巯基乙醇，使终浓度达 2% (v/v)。将此溶液及 CTAB/NaCl 溶液加热至 65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要 4 ml 的 2 -巯基乙醇/CTAB 抽提液和 0.4～0.5 ml 的 CTAB/NaCl 溶液；

2. 用液氮 (- 196℃) 或干冰 (- 78℃) 冷冻匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个含有机溶剂的试管或烧瓶中；

3. 往粉碎的组织中加入预热的 2 -ME/CTAB，混合使之充分湿润，于 65℃ 温育 10～60 min，期间不时混匀；

4. 用等体积的 24:1 氯仿/异戊醇抽提匀浆液，上下颠倒充分混合，7500×g，4℃，离心 5 min，回收上层水相；

5. 加入 1 / 10 倍体积的 65℃ 预热 CTAB/NaCl 溶液，上下颠倒混匀；

6. 用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，离心，回收上层水相；

7. 加入 1 倍体积的 CTAB 沉淀液，上下颠倒混匀，如果沉淀可见，继续做步骤 8，也可于 65℃ 温育 30 min；

8. 500×g，4℃，(或约 2700rpm) 离心 5 min；

9. 移出上清，用高盐 TE 缓冲液重悬沉淀 (按每克起始材料加 0.5～1 ml)，如果沉淀很难溶解，于 65℃ 温育直至所有的或大部分沉淀溶解；

10. 加入 0.6 倍体积异丙醇沉淀核酸，充分混匀，7500×g，4℃，离心 15 min；

11. 用 75% 乙醇洗涤沉淀物，干燥，用尽可能少的 TE 或水重悬 (每克起始材料 0.1～0.5 ml)。

二、质粒 DNA 的制备

（一）质粒的小量制备:

1. 将 5 ml LB 培养液 (含筛选抗生素) 加入到容量为 15 ml 并通气良好的试管中，然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中，37℃ 以 225rpm 速度振荡培养 14 - 16 h；

2. 10,000rpm，4℃ 离心 5 min，弃培养液；

3. 用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来，室温放置 5 min；

4. 加入细菌裂解液，上下颠倒微量离心管以裂解细菌，待溶液变黏稠为止；
   

5. 加入中和液，上下颠倒混合后置冰上 5 min，12,000rpm，4℃ 离心 5 min；

6. 将上清移至另一离心管中 (注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的 TE 饱和酚/ 氯仿 (1:1) 混合液，振荡混匀 1 min，12,000rpm 离心 2 min；

7. 将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1) 溶液，振荡混匀 1 min，12,000rpm 离心 2 min；

8. 将上层水相移至另一离心管中，加入 2.5 倍体积的无水乙醇，置- 20℃ 沉淀 15 - 30 min，然后 12,000 rpm 离心 15 min；

9. 弃上清，于沉淀中加入 100? 滋 L 双蒸水或 TE(pH8.0) 溶解沉淀，加入 20? 滋 g/ml RNase，置室温 30 min，然后加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1)，振荡混匀 1 min，12,000rpm 离心 2 min，将上层水相移至另一离心管中，加入 0.1 倍体积 3M NaAc(pH5.2) 和 2.5 倍体积无水乙醇，置- 20℃ 沉淀 15～30 min，然后离心 15 min；

10. 弃上清，加入 70% 乙醇 ( 注意不要混合)，12000rpm 离心 10 min；

11. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒 DNA；

12. 用去离子水溶解质粒 DNA，- 20℃ 保存备用。

（二）质粒的大量制备:

1. 将 5 ml 转化菌种接种于 500 ml LB 培养液 (含用于筛选的抗生素) 中，37℃ 以 225rpm 速度振荡培养 12～16 小时；

2. 10,000rpm，4℃ 离心 15 min 收集菌体；

3. 将细菌悬浮于 100 ml 预冷的 STE（0.1M NaCl，10 mM Tris.Cl，pH8.0，1 mM EDTA，pH8.0）中，12,000rpm 离心收集菌体；

4. 将菌体悬于 10 ml 细菌悬浮液中，再移至 50 ml 离心管中；

5. 加入 1 ml 用 10 mM Tris.Cl (pH 8.0) 新鲜配制的溶菌酶溶液 (10 mg/ml)，混合后室温孵育 30 min；

6. 加入 15 ml 新鲜配制的细胞裂解液，上下颠倒混合直至溶液变黏稠为止；

7. 加入 10 ml 预冷的中和液，上下颠倒混匀，冰浴 10 min；

8. 12,000rpm，4℃ 离心 20 min；

9. 将上清通过四层消毒纱布滤入另一 50 ml 离心管中，加入 0.6 倍体积的异丙醇，室温放置 10 min，12,000rpm，室温离心 5 min；

10. 弃上清，于沉淀中加入水和 RNase，置室温 30 min，然后用氯仿/异戊醇 (24:1) 抽提一次，于上层水相中加入 0.1 倍体积 3M NaAC（pH5.2）和 2.5 倍体积无水乙醇，- 20℃ 沉淀 15 min，12,000rpm 离心 15 min；

11. 弃上清，用 75% 乙醇室温洗一次，12,000rpm，离心 10 min；

12. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒 DNA；

13. 加适量去离子水或 TE 缓冲液 (pH8.0) 溶解质粒 DNA，- 20℃ 保存备用。

三、 DNA 酶切后片段回收与载体连接

1. 酶切 DNA 反应，在 75℃ 加热 15 min 灭活酶活性；

2. 10×CIP 缓冲液和 1U CIP，混合后，37℃ 孵育 30～60 min，然后 75℃ 加热 15 min 灭活 CIP 活性；

3. 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的 DNA 片段用于连接反应。

连接反应：连接体系混合后置 14～16℃ 水浴 6～12 h。

四、重组质粒的转化

（一）感受态细胞的制备

1. 将大肠杆菌菌株在 LB 琼脂培养基上画线，37℃ 培养 12～16 h；

2. 次日从琼脂平板上取一单菌落于 2 ml LB 培养基中，37℃ 以 200 rpm 速度振荡培养 12～16 h；

3. 取 1 ml 上述培养物接种于 100 ml LB 培养基中，37℃ 以 200 rpm 的速度震荡培养直至 A600 值为 0.5～0.6 (大约 3 h)；

4. 将菌液置冰浴 10 min，然后 2,500×g，4℃ 离心 20 min 收集菌液；

5. 弃上清，倒置离心管 1 min 除净剩余液体，然后加入 10 ml 冰冷的 100 mM CaCl₂ 液悬浮细胞，冰浴 10 min；

6. 4000rpm，4℃ 离心 10 min 回收细胞，弃上清，每 50 ml 原培养物再加入 2 ml 冰冷 100 mM CaCl2 溶液悬浮细胞；

7. 按每份 200? 滋 l 分装，4℃ 可保存 1～2 周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为 15%，置- 70℃ 备用。
   

（二）重组质粒的转化

1. 将感受态细胞置冰上融化，然后加入 DMSO 或 2 -巯基乙醇，混合后加入 L 连接反应液 (含重组质粒)，温和混匀，置冰上 30 min；

2. 42℃ 水浴 45 秒，然后迅速放回冰中 1～2 min；

3. 加入 2 ml LB 培养液，37℃ 轻摇荡培养 1 h；

4. 4,000×g 离心 10 秒钟，弃上清，用 LB 培养液重悬菌体；

5. 将菌液铺于含有适当抗生素的 LB 琼脂培养板上，涂匀，室温放置 20～30 min，倒置于 37℃ 孵箱中培养 12～16 h。

（三）转化细胞的筛选

（四）质粒和菌株的保存

1. 质粒可以在- 20℃ 冰冻保存。

2. 菌株可在含 8～15% 甘油培养液中- 20℃ 或- 70℃ 保存。也可在半固体 LB 琼脂培养基中穿刺保存。

DNA 体外重组的注意事项有：

（一）选择载体的基本原则：一是明确选用载体的基本目的，二是了解载体的基本结构和功能元件。载体选择一般应考虑以下几点：1 目的 DNA 片段的大小；2 明确重组的目的；3 合适的克隆位点；4 载体的稳定性。

（二）选择载体需要考虑的因素：选择载体时除了遵守上述基本原则外，还应考虑一些可能对操作 DNA 有影响的因素，包括载体提供的一些重要元件及其位置、可用于操作的位点以及载体在宿主细胞中的行为方式等。

（三）因为 RNA 易被 RNase 降解；整个操作不能有 RNase 的污染，同时要注意无菌操作。

（四）所有试剂的配制均用 DEPC 处理过的水。