体外重组

载体与外源DNA分子体外重组时，如何选择优化连接条件以达到最高的重组率。因此有必要根据影响连接效率的因素综合考虑连接条件。影响连接效率的因素很多，如反应温度、插入片段和载体之间的摩尔比、DNA末端性质、反应时间、ATP浓度等。

1. 反应温度是比较重要的影响因素。因为连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下仅含4-6bp的退火粘末端之间的氢键结合不稳定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒热运动的破坏，因此连接温度应介于酶的最适温度和粘末端退火温度之间，一般为4-22℃，平末端连接温度要更低些。退火粘末端之间的连接可视为分子内的连接，而平末端之间为分子间的连接。

从分子动力学角度讲，后者更为复杂，且速度也要慢得多，因此平末端的连接效率要低一些为粘末端连接效率的1/10-1/100。一般采用如下组合：粘端连接反应16℃12小时或22℃4-5小时，平端连接反应4-8℃12小时。

2. 插入片段和载体之间的摩尔比经验值一般为3-10， 即插入片段要多于载体数，这样有利于提高重组率。一般的计算公式为：

 

3.连接酶用量一般为0.1-2U,平端连接酶用量要高一些。

4.ATP浓度一般为10μΜ-1mM ,但载体环化受ATP浓度影响较大，当ATP浓度为0.1mM 环化程度最大。

5.如在反应缓冲液加一定浓度PEG可以提高连接效率。

一、材料，试剂和仪器

1 材料:质粒载体，插入DNA片段

2 试剂: Promega 公司的T4DNA连接酶试剂盒

3仪器：恒温水浴锅

二、实验程序

1 连接

1) 采用20μl的体系，在灭菌的200μlEppendorf管中顺序加入：

 

2）14-16℃连接反应过夜。

三、结果与分析

连接成功与否，有的实验指导书上建议连接后采用电泳检测，除载体和目的DNA片段外，还应出现一条或几条电泳相对滞后的重组DNA带，表明重组成功。这在载体和目的DNA片段充足的条件下检测不失为一种直观的方法。但如果载体和目的DNA片段量较少，这种检测就不经济了，倒不如做载体和插入片段不同比例的连接体系能获得好结果。