体外DNA重组技术

在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。

DNA重组技术的基本程序包括：

（1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。

（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的DNA分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。

（3）连接：目的DNA片段和适当载体的连接,一般采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。

（4）转化：将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。

（5）克隆化：重组DNA分子转化大肠杆菌后，在平板培养基上筛选出单个菌落，此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。

下面以质粒为例图示DNA体外重组的基本程序：

一、基因组DNA的制备

【实验目的】

1． 理解生物细胞基因组DNA制备方法的原理。

2． 熟悉组织细胞基因组DNA制备的基本操作。

【实验原理】

在阴离子去污剂（SDS-十二烷基硫酸钠）以及酚/氯仿/异戊醇作用下可以使细胞膜破坏，核蛋白质变性，将染色体DNA分离出来。

【实验对象】

新鲜哺乳动物组织或细胞。

（一）从哺乳动物组织中提取基因组DNA

【实验试剂与器材】

1. 消化缓冲液：100mM NaCl，10mM Tris.Cl (pH8.0)

　25mM EDTA (pH8.0)，0.5% (w/v) SDS，0.1mg/ml蛋白酶K。

2. 7.5mol/L乙酸铵。

3. 100%乙醇。

4. 酚/氯仿/异戊醇。

【实验方法与步骤】

1. 将新鲜组织剪成小块并立即置于液氮中冻存；

2. 将200mg～1g的组织用预冷的研钵研碎，或用锤子将其捣为细粉末，每100mg组织用1.2ml消化缓冲液悬浮，然后于50℃摇荡温育12~18h；

3. 用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700×g，离心10min。如果样品溶解得不好，再加1体积不含蛋白酶K的消化缓冲液，重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质，重复抽提一次，将上层(水溶液)转移至一个新离心管中；

4. 加入1/2体积7.5mol/L乙酸铵和2倍体积100%乙醇，12 000rpm离心2min；

5. 用70%乙醇洗涤，晾干，沉淀用TE缓冲液或无菌双蒸水重新溶解,使终浓度在约1mg/ml。注: 加入0.1%的SDS和1?滋g/ml无DNA酶的RNA酶，37℃温育1h，以除去残留的RNA。

6. 重复步骤4、5。1g细胞大约能提取到2mg DNA。

（二）从植物组织中提取基因组DNA

【实验试剂与器材】

1. CTAB抽提液：2% (w/v) CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，100mM Tris.Cl，pH8.0， 20mM EDTA，pH8.0，1.4M NaCl

2. CTAB/NaCl溶液：10% CTAB，0.7M NaCl

配制方法：在80ml双蒸水中溶解4.1g NaCl，然后缓慢加入10g CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，同时加热并搅拌，可加热至65℃溶解，定容终体积至100ml。

3. CTAB沉淀液： 1% (w/v) CTAB，50mM Tris.Cl (pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)

4. 高盐TE缓冲液: 10mM Tris.Cl (pH8.0)，0.1mM EDTA (pH8.0)，1M NaCl

【实验方法与步骤】

1. 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巯基乙醇，使终浓度达2% (v/v)。将此溶液及 CTAB/NaCl溶液加热至65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2-巯基乙醇/CTAB抽提液和0.4~0.5ml的CTAB/NaCl溶液；

2. 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷冻匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个含有机溶剂的试管或烧瓶中；

3. 往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育10~60min，期间不时混匀；

4. 用等体积的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，上下颠倒充分混合，7500×g，4℃，离心5min，回收上层水相；

5. 加入1/10倍体积的65℃预热CTAB/NaCl溶液，上下颠倒混匀；

6. 用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，离心，回收上层水相；

7. 加入1倍体积的CTAB沉淀液，上下颠倒混匀，如果沉淀可见，继续做步骤8，也可于65℃温育30min；

8. 500×g，4℃，(或约2700rpm)离心5min；

9. 移出上清，用高盐TE缓冲液重悬沉淀(按每克起始材料加0.5～1ml)，如果沉淀很难溶解，于65℃温育直至所有的或大部分沉淀溶解；

10. 加入0.6倍体积异丙醇沉淀核酸，充分混匀，7500×g，4℃，离心15min；

11. 用75%乙醇洗涤沉淀物，干燥，用尽可能少的TE或水重悬(每克起始材料0.1～0.5ml)。

【注意事项】

基因组DNA分子量大，所有操作必须轻柔，酚/氯仿对皮肤有腐蚀作用，应该戴手套操作。

二、RNA的制备

【实验目的】

1． 理解生物细胞中RNA制备方法的原理。

2． 熟悉组织细胞中RNA制备的基本操作。

（一）细胞总RNA的提取

1. 异硫氰酸胍法

【实验原理】

异硫氰酸胍法提取细胞总RNA是目前常用的提取方法，其基本原理是：异硫氰酸胍(GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性，通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNA。

【实验对象】

新鲜哺乳动物组织或细胞

【实验试剂与器材】

（1）GuSCN缓冲液：

4 M异硫氰酸胍(GuSCN) ，25mmol/L 柠檬酸(pH7.0)，0.5% 十二烷基肌氨酸钠（SLS）。配制方法：先称取GuSCN加少量双蒸水溶解，然后加入其余成分，65℃加热使其充分溶解，4℃保存备用。

（2）GuSCN/25mmol/L β-巯基乙醇溶液：

将0.36ml β-巯基乙醇溶于200ml GuSCN缓冲中，4℃保存备用。

（3）2M NaAc (pH 4.0)

（4）0.1% DEPC-H2O：将0.1 ml DEPC加入100ml双蒸水中，室温摇晃12~24小时，然后15磅高压15min（注意：若用此水处理容器，可以不用高压处理）

（5）氯仿:异戊醇 (49:1, v/v)

（6）DEPC-H2O饱和酚：

将DEPC-H2O和酚1:1混合，室温摇晃1小时，然后静止使其分层，吸除水相，再加入DEPC-H2O重复一次，此即DEPC-H2O饱和酚。

（7） 无水乙醇

（8） 75%冰冷乙醇

【实验方法与步骤】

（1）取离心洗涤后的1×106培养细胞或相当量的研磨后的组织，加入200?滋l GuSCN/25mM）-巯基乙醇溶液，剧烈震荡使细胞裂解，此时溶液变黏稠；

（2）加入下列成分：2M NaAc (pH4.0) 25?滋l，DEPC-H2O饱和酚240?滋l，氯仿:异戊醇 (49:1,v/v) 50?滋l，剧烈震荡10秒钟，冰浴15min；

（3）4℃，10,000×g离心30min，使其充分分层，水相应透明无任何混浊 [注：RNA在上 层水相，DNA和蛋白质在中间相和酚相中]；

（4）将上层水相转移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；

（5）弃上清，加入100?滋l GuSCN缓冲液将RNA沉淀溶解，然后加入200?滋l无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；

（6）弃上清，用75?滋l DEPC-H2O溶解RNA沉淀，加入7.5?滋l 2M NaAc (pH4.0)，165?滋l无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；

（7）弃上清，加入75%乙醇(-20℃)1ml，不要混合，4℃，7500×g离心10min；

（8）弃上清，室温自然干燥RNA沉淀 (注意：RNA沉淀不能过分干燥，否则将无法使其溶解)；

（9） 用DEPC-H2O溶解RNA备用。若长期保存，应将RNA悬于75%乙醇中置-20℃。

【注意事项】

1. 所有试剂均用DEPC-H2O配制；操作中要防止RNA酶的污染，必须戴手套，戴口罩，玻璃器皿可在烤箱中180℃烘烤2h，灭活RNA酶，或者用新的。

2. Trizol试剂法：原理、试剂、器材.

用Trizol试剂(美国Gibco公司产品)在室温下可提取RNA、DNA及蛋白质，具有快速方便、提取量大等优点。

【实验方法与步骤】

（1）0.5~1×107 细胞或相当量的组织，用1ml Trizol试剂裂解细胞，摇动混合后室温孵育5~10min；

（2）加入2氯仿，震荡混匀15秒，置室温2～3min；

（3）10,000×g，4℃离心15min，将水相移至另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，混合后室温沉淀10min，10000×g离心10min；

（4）弃上清，加入1ml 75%乙醇，不混合，7500×g离心10min；

（5）弃上清，室温下空气蒸发残存的乙醇。

3. Oligo(dT)纤维素层析法提取mRNA

【实验原理】

真核细胞的3’端有poly(A)尾，因此可用Oligo(dT)纤维素结合mRNA，从而将mRNA从总RNA中分离出来。Oligo(dT)纤维素就是将Oligo(dT)15～18结合到纤维素上，制备成能特异性结合带Poly(A)尾RNA的纤维素。

【实验试剂与器材】

（1）Oligo(dT)纤维素

（2）层析柱装置

（3）1×上样缓冲液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸钠(SLS)

配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分确切含量后，15磅高压15分钟，待溶液冷却至65℃时，加入预先在65℃水浴30min的10% SLS，至终浓度为0.1%。也可用0.05M柠檬酸钠代替Tris.HCl。然后用0.1%DEPC处理整个缓冲液。

（4）洗脱缓冲液: 10 mM Tris.HCl (pH7.6)，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.05% SDS

先将Tris.HCl和EDTA混合后高压，然后加10%SDS至所需浓度，此缓冲液配制后不可高压。

（5）3M NaAc (pH5.2)

（6）DEPC (焦碳酸二乙酯,sodium acid pyrophophate)处理水：0.1% DEPC双蒸水，37℃摇动温育至少12h，然后15磅高压15min。

【实验方法与步骤】

（1）将0.5～1g的Oligo(dT)纤维素悬于0.1M NaCl溶液中，然后用0.5~1ml装柱；用3倍柱容积的DEPC-H2O洗柱，再用1×上样缓冲液洗柱，至洗出液pH<8.0；

（2）将RNA溶液在65℃加热5min，然后迅速冷却至室温，加入等体积的2×上样缓冲液，混合后直接上样，并收集流出液。重复此过程2-3次以使mRNA更充分地结合到纤维素上；

（3）用2～3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱mRNA；

（4）加入1/10容积的3M NaAc (pH5.2)于mRNA洗脱液中，混合后加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后-20℃沉淀30min；

（5）10000×g，4℃离心15min，弃上清。用70%乙醇漂洗，10000×g离心5min，弃上清,室温蒸发乙醇；

（6）用适量的无RNase污染的水溶解mRNA。此mRNA可用于Northern印迹，RT-PCR及核酸保护试验。若长期保存，可加入3倍体积的无水乙醇，置-70℃。

【注意事项】

（1）因为RNA易被RNase降解；整个操作不能有RNase的污染，同时要注意无菌操作。

（2）所有试剂的配制均用DEPC处理过的水

（3）加入3倍体积的100%乙醇于RNA溶液中，-70℃可长期保存.

（4）此RNA可用于第一股cDNA的合成，Northern印迹，核酸酶保护试验等。

三、质粒DNA的制备

【实验目的】

熟悉质粒DNA常用的制备方法

【实验原理】

转化细胞中的质粒DNA制备主要包括三个步骤：细菌的培养、收获和裂解、质粒的分离和纯化。低浓度的碱和SDS可以有效地裂解细菌的细胞壁，从而使质粒释放出来。

【实验试剂与器材】

1. 细胞悬浮液: 50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl,（ pH8.0），10mM EDTA.Na2,（pH8.0）

2. 细菌裂解液: 0.2mol/L NaOH，1% SDS

3. 中和液: 60ml 5M醋酸钾，11.5ml 冰醋酸，28.5ml双蒸水

4. 3mol/L NaAc (pH 5.2)

5. TE饱和酚 (pH8.0)

6. 氯仿/异戊醇 = 24:1

7. RNase（20mg/ml）

【实验方法与步骤】

（一）质粒的小量制备:

1. 将5ml LB培养液(含筛选抗生素)加入到容量为15ml并通气良好的试管中，然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中，37℃以225rpm速度振荡培养14-16h；

2. 10,000rpm，4℃离心5min，弃培养液；

3. 用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来，室温放置5min；

4. 加入细菌裂解液，上下颠倒微量离心管以裂解细菌，待溶液变黏稠为止；

5. 加入中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000rpm，4℃离心5min；

6. 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和酚/ 氯仿(1:1)混合液，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min；

7. 将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min；

8. 将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀15-30min，然后12,000 rpm离心15min；

9. 弃上清，于沉淀中加入100?滋L双蒸水或TE(pH8.0)溶解沉淀，加入20?滋g/ml RNase，置室温30min，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min，将上层水相移至另一离心管中，加入0.1倍体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置-20℃沉淀15~30min，然后离心15min；

10. 弃上清，加入70%乙醇( 注意不要混合)，12000rpm离心10min；

11. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒DNA；

12. 用去离子水溶解质粒DNA，-20℃保存备用。

（二）质粒的大量制备:

1. 将5ml转化菌种接种于500ml LB培养液(含用于筛选的抗生素)中，37℃以225rpm速度振荡培养12～16小时；

2. 10,000rpm，4℃离心15min收集菌体；

3.将细菌悬浮于100ml预冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0）中，12,000rpm离心收集菌体；

4. 将菌体悬于10ml细菌悬浮液中，再移至50ml离心管中；

5. 加入1ml用10mM Tris.Cl (pH 8.0)新鲜配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，混合后室温孵育30min；

6. 加入15ml新鲜配制的细胞裂解液，上下颠倒混合直至溶液变黏稠为止；

7. 加入10ml预冷的中和液，上下颠倒混匀，冰浴10min；

8. 12,000rpm，4℃离心20min；

9. 将上清通过四层消毒纱布滤入另一50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10min，12,000rpm，室温离心5min；

10. 弃上清，于沉淀中加入水和RNase，置室温30min，然后用氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，于上层水相中加入0.1倍体积3M NaAC（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，-20℃ 沉淀15min，12,000rpm离心15min；

11. 弃上清，用75%乙醇室温洗一次，12,000rpm，离心10min；

12. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒DNA；

13. 加适量去离子水或TE缓冲液(pH8.0)溶解质粒DNA，-20℃保存备用。

四、 DNA酶切，电泳分离与片段的回收

【实验目的】

掌握常用限制性内切酶的作用特点以及使用方法。

掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的操作与DNA片段的回收。

【实验原理】

目的DNA被限制性核酸内切酶水解后产生大小不同的DNA片段，这些DNA片段在一定浓度的琼脂糖凝胶电泳上可以按分子大小不同而分开，并可以用不同的方法再把这些DNA片段从琼脂糖凝胶上回收回来。

限制性核酸内切酶水解DNA的活性与酶的单位数，缓冲液的离子强度和反应温度有关。

【实验试剂与器材】

限制性内切酶

10×内切酶缓冲液

琼脂糖

（一）DNA分子的酶切消化

【实验方法与步骤】

DNA分子用限制性内切酶消化，通常按下列比例进行：

双蒸馏水 适量

10×内切酶缓冲液 1/10体积

DNA 1μg

限制性内切酶 1/10体积 (DNA用1-10U)

总体积 混匀后37℃温育30～120min

（二）DNA酶切片段的琼脂糖凝胶电泳

【实验原理】

核酸在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构，以其为介质进行电泳时，不同大小的核酸可借凝胶的分子筛作用而得以分开。用溴化乙啶染色后，在紫外灯下，可见橘红色的核酸条带。琼脂糖凝胶常制成水平平板状，电泳缓冲液覆盖在平板表面，加样后，通电进行电泳，故称为潜水式电泳。

【实验试剂与器材】

1. ５×TBE: 54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，配1升。

2. 0.5xTBE: 取5×TBE 作10倍稀释

3. 溴化乙啶液： 10mg/ml水

4. ６×载样缓冲液： 0.25%溴酚蓝，40%(W/V)蔗糖水溶液

【实验方法与步骤】

1. 铸胶　1g琼脂糖加0.5xTBE缓冲液100ml，在微波炉上加热融化，冷却至放在手背不觉烫手（约50℃）后，倾入架有样品孔形成器（梳子）的微型水平电泳槽中。胶液固化后，倒入0.5xTBE至高出胶面1～2mm，拔出梳子，接好电源线（注意正负极）。

2. 加样 核酸样品中加入样品体积1/6的6x载样缓冲液，混匀后，用移液器加入样品孔内。

3. 电泳　接通电源，施加的电压应小于5v/cm，待溴酚蓝跑至适当位置时，关闭电源。

4. 染色和结果观察 向微型电泳槽内滴加溴化乙啶液，至终浓度约为0.5μg/ml，混匀后放置约30min，在254nm紫外灯下观察电泳结果，做好记录。

【注意事项】

1. 溴化乙啶是致癌剂，并有中度毒性，实验中要戴防水手套，不要污染环境。紫外灯下观察结果时，应戴防护眼镜。

2. 也可将溴化乙啶预先加入琼脂糖中，使浓度达0.5μg/ml进行配胶。

3. 琼脂糖的浓度一般用0.8%~1.2% ,可随欲分离核酸分子的大小作调整，分子大用低浓度凝胶，分子小用高浓度胶。分离RNA时要用变性胶。

（三）DNA酶切片段的回收

【实验方法与步骤】

1. 冻融法:

（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，-70℃冷冻至少15min，然后在65℃水浴中使胶融化；

（2）加入等倍体积TE-饱和酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15min；

（3）室温融化后，12,000rpm离心5min，将上层水相移至另一离心管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA片段，离心后的沉淀用75%乙醇漂洗一次，室温干燥DNA，用双蒸水或TE缓冲液溶解DNA后，-20℃保存备用。

2. 低熔点琼脂糖法:

（1）在UV灯下，用手术刀片在待回收DNA片段前方挖一槽，然后用同样浓度的低溶点琼脂糖将槽填平，继续电泳至待回收DNA片段进入低熔点琼脂糖中；

（2）在UV灯下，用手术刀片将含DNA的低熔点琼脂糖凝胶切下，37℃水浴10min至凝胶融化为止；

（3）加入等体积的TE饱和酚/氯仿(1:1)抽提，12000rpm离心5min；

（4）将上层水相移至另一离心管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉出、75%乙醇漂洗一次，晾干备用。

3. DNA回收试剂盒（玻璃乳法）:

（1）在UV灯下，从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶，放入一离心管中；

（2）加入3倍体积的6mol/L NaI溶液，45～55℃水浴5～10min使胶完全融化；

（3）加入10?滋l玻璃乳悬液，轻弹管底混匀，然后45～55℃水浴5～10min，期间每2～3min混匀一次；

（4）5000rpm离心30~60秒，弃上清；

（5)加400?滋l漂洗液（20mM Tris.Cl，pH7.4/1mM EDTA/100mM NaCl和等体积无水乙醇），轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清；

（6）再加入漂洗液，轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清，并用加样器尽量除净漂洗液，然后室温晾干；

（7）加10~30?滋l无菌双蒸水或TE缓冲液将玻璃乳悬浮起来，45～55℃水浴5～10min；

（8）10000rpm离心1～2min，回收上清备用。

【注意事项】

漂洗玻璃毛时不可用加样器上下吹打，从玻璃毛上洗脱DNA时则相反。

五、 载体与DNA片段的连接反应

【实验目的】

学习和掌握DNA连接酶的使用原则和基本方法

【实验原理】

DNA连接酶可以在两个双链DNA分子相邻的5'-磷酸与3'-羟基之间形成磷酸二酯键，从而可以实现重组DNA分子的构建。一般在连接反应之前，DNA分子都要进行限制性内切酶消化，使待重组的DNA分子具有相匹配的末端，黏性末端连接和平齐末端连接是最常用的，但不匹配的末端也可以经过修饰实现连接。

下面以质粒DNA为载体，介绍目的DNA片段与载体的连接。

黏性末端的连接涉及三种情况：①载体和DNA片段经双酶切后，两端具有不同的粘端，可以直接进行连接反应。②载体和DNA片段单酶切后，在DNA片段两端是互补的粘端。DNA片段插入载体时具有正反两个方向。③平齐末端连接需要在DNA5'-端去磷酸化，否则线性载体DNA分子将发生自身环化连接。

（一）5'-端去磷酸化反应

通常只对载体DNA分子进行5'-端去磷酸化反应就基本可以避免自身环化连接。

【实验试剂与器材】

1. 小牛肠磷酸酶 (Calf intestine phosphatase ,CIP)

2. 10×CIP缓冲液

【实验方法与步骤】

1. 酶切DNA反应，在75℃加热15min灭活酶活性；

2. 10×CIP缓冲液和1U CIP，混合后，37℃孵育30～60min，然后75℃加热15min灭活CIP活性；

3. 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的DNA片段用于连接反应。

（二）连接反应

【实验试剂与器材】

1. T4 DNA连接酶

2. 10×T4连接酶缓冲液

【实验方法与步骤】

反应体系：

质粒DNA (0.5(g/?滋l) 2?滋l

DNA插入片段(300ng/?滋l) 5?滋l

10× 连接缓冲液 1?滋l

T4 DNA连接酶 1?滋l

加水至总体积 10ul

混合后置14～16℃水浴6～12h。

【注意事项】

1）通常DNA插入片段与载体DNA的摩尔比为3:1或2:1，需根据DNA分子量计算，而不取决于浓度；2）平齐末端连接时，插入片段的量要远远大于载体DNA的量，可以为5:1或更多，即使这样，连接效率仍然很低。3）有时DNA一端是粘端，另一端是平端，这种连接与双酶切粘端连接相似；4）不匹配末端需要连接时，首先要将末端处理成平端，然后再进行连接反应。

六、重组质粒的转化

【实验目的】

学习和掌握感受态细胞的制备方法和转化实验的基本操作。

【实验原理】

将重组质粒转入大肠杆菌的过程称为转化。转化所用的大肠杆菌需要用物理或化学方法特殊处理，使重组DNA分子容易进入细胞内，被处理后易于接纳DNA分子的细胞称作感受态细胞。下面介绍感受态细胞的制备。

【实验试剂与器材】

大肠杆菌菌株，LB培养基，100mM CaCl2 ，DMSO或2-巯基乙醇，离心机，振荡器，冰浴

【实验方法与步骤】

（一）感受态细胞的制备

1. 将大肠杆菌菌株在LB琼脂培养基上画线，37℃培养12～16h；

2.次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以200 rpm速度振荡培养12～16h；

3.取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以200 rpm的速度震荡培养直至A600值为0.5～0.6 (大约3h)；

4. 将菌液置冰浴10min，然后2,500×g，4℃离心20min收集菌液；

5. 弃上清，倒置离心管1min除净剩余液体，然后加入10ml冰冷的100mM CaCl2液悬浮细胞，冰浴10min；

6. 4000rpm，4℃离心10min回收细胞，弃上清，每50ml原培养物再加入2ml冰冷100mM CaCl2溶液悬浮细胞；

7. 按每份200?滋l分装，4℃可保存1~2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15%，置-70℃备用。

【注意事项】

大肠杆菌必须从LB培养基琼脂平板上获得单菌落，37℃过夜培养12～16h，第二天按1～5%接种，直至A600值为0.5～0.6；

（二）重组质粒的转化

1. 将感受态细胞置冰上融化，然后加入 DMSO或2-巯基乙醇，混合后加入L连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30min；

2. 42℃水浴45秒，然后迅速放回冰中1～2min；

3. 加入2ml LB培养液，37℃轻摇荡培养1h；

4. 4,000×g离心10秒钟，弃上清，用LB培养液重悬菌体；

5. 将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20～30min，倒置于37℃孵箱中培养12～16h。

（三）转化细胞的筛选

【实验原理】

1、 蓝白筛选:

以TA克隆载体pRCII转入大肠杆菌为例。TA克隆载体pRCII含有LacZ基因，多克隆酶切位点位于其间，当没有外源基因插入LacZ基因中时，LacZ基因的启动子可使此基因编码半乳糖苷酶，从而催化底物X-gal发生化学反应，菌落变成蓝色；当外源基因与pRCII载体发生连接时，LacZ基因失活，菌落呈白色；同时该质粒还含有氨苄青霉素耐药基因。根据此特性，白色菌落含有重组质粒。在用这种质粒进行克隆时，转化平板培养基中要加入0.5mM IPTG、50g/ml氨苄青霉素及140g/ml X-gal。

作为载体的质粒都含有一种或两种抗生素的耐药基因，当把这种质粒转入大肠杆菌后，此菌便获得了抵抗这种抗生素的能力。目前分子克隆所用的克隆载体多含氨苄青霉素耐药基因，所以涉及最多的是氨苄青霉素筛选。当将氨苄青霉素加入培养基中后，只有含质粒的细菌能够繁殖，而不含质粒的细菌则不能繁殖形成菌落。此种筛选不能鉴别重组质粒或自身环化的质粒。在用含氨苄青霉素耐药基因的质粒进行克隆时，转化平板培养基中要加入氨苄青霉素。

（四）质粒和菌株的保存:

1. 质粒可以在-20℃冰冻保存。

2. 菌株可在含8～15%甘油培养液中-20℃或-70℃保存。也可在半固体LB琼脂培养基中穿刺保存。

　思 考 题

1． 描述体外DNA重组的基本过程。

2． 名词解释：质粒、限制性核酸内切酶、感受态细胞、转化、α互补。

3. 限制性核酸内切酶切割DNA片段后的连接需要考虑哪些问题。

4. 构建一个克隆载体的必要条件有哪些。