体外转录，模版DNA必须是双链吗，单链DNA可以作为模版吗？

单链DNA可以作为模板，但是起始必须是双链。

DNA模板必须包含噬菌体聚合酶结合并开始RNA合成所需的双链启动子区域。转录模板包括经克隆构建的质粒、基于RNA前体进行第一链及第二链合成（例如aRNA扩增）得到的cDNA模板，以及通过PCR方法或对化学合成的寡核苷酸进行退火所得到的线性模板等。

在设计转录模板时，必须确定需要的是正义链还是反义链转录本。若RNA是要用作与信使RNA杂交的探针（例如：Northern blot、原位杂交、核酸酶保护实验等），则需要互补的反义链转录本。反之，当进行表达、结构或功能研究时，或使用人工正义链RNA来构建RNA定量的标准曲线时，则需要正义链转录本。

DNA模板上的RNA聚合酶启动子序列+1 G是转录产物中的第一个碱基。为了获得正义RNA，编码链的5’末端应当与启动子的+1 G相连，或正好处于下游。若要转录反义RNA，则是非编码链的5’末端应当与+1 G相连。若插入片段是在载体中，则应当在启动子和需转录插入序列的下游对载体进行线性化

DNA的两条链不能同时作为转录的模板链。因为DNA双链中只有一条链有转录功能，而另一条链是它的互补碱基，不能做起点。

转录时是以DNA的一条链为模板，能转录出起始密码子的那一条链为模板。