体外受精技术

体外受精（in vitro fertilization，IVF）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称为试管动物（test-tube animal）。

体外受精技术的核心包括：成熟卵母细胞的获得、体外受精及胚胎培养。

器材：

①大鼠发情检测仪PortableEstrus Cycle Monitor EC40

④CO₂培养箱

试剂：

显微受精技术的基本过程可分为如下几步：

一、大鼠成熟卵母细胞的获取

（1）大鼠超数排卵处理：挑选4～6周龄的健康成年雌性大鼠；于17：00注射马血清促性腺激素（PMSG）；48-52小时后注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）。

（2）大鼠自然发情母鼠的挑选：挑选8周龄的健康性成熟雌性大鼠；利用大鼠发情检测仪PortableEstrus Cycle Monitor EC40检测大鼠阴道电阻值，挑选仪器示数＞5.0的雌性大鼠。

（3）采集大鼠输卵管内的成熟卵母细胞：注射hCG12-16小时后，断颈法处死雌性大鼠；将处死的大鼠仰卧固定于实验台上，用乙醇喷雾小鼠腹部，进行表面消毒。

用无菌手术器械剪取双侧雌性大鼠输卵管；剪下输卵管壶腹部，放入预热并添加有5 μmol／LMG132的M2体外操作液中；快速划破输卵管壶腹部、使卵团游离出来。

将卵团迅速转入含有5 μmol／LMG132和0.1 mg／ml透明质酸酶（hyaluronidase）的M2体外操作液中2～3分钟。结合口吸管的反复吹吸，以去除包裹在颗粒细胞-卵母细胞复合体（cumulus-oocylecomplexes，COCs）外层的颗粒细胞。

将卵母细胞重新转移至含5 μmol／L MG132的M2体外操作液中，清洗2～3遍；放入预热的含有5 μmol／L MG132的大鼠胚胎培养液mRIECM-IC微滴中；放入37 ℃，5％ CO₂培养箱中备用。

二、精子的采集与活力检查

（1）取3月龄以上有繁育能力的雄鼠，颈椎脱白处死。

（2）腹部75％ 乙醇消毒，打开腹腔，取附睾尾。

（3）用眼科剪小心将附睾尾周围的脂肪剥离，在灭菌滤纸上去除血迹和脂肪。

（4）用眼科剪在附睾尾上剪个小口，可见有乳白色精子团涌出，用穿刺针挑入预先平衡过夜的受精液滴（添加30 mmol／L NaCl的IVF20）中。

（5）温箱孵育5分钟后，用血细胞计数板计数后求出精子浓度：精子浓度＝（四格精子数总和）／4x10／ml。

（6）取10～30 μl精子悬液，移入另一新鲜液滴，使精子浓度达1.0x10／ml，培养条件为5％ CO₂、95％ 空气、饱和湿度和37 ℃，获能5～7小时。计算精子活力：精子活力＝前进运动的精子／总精子数x100％。

三、体外受精操作

（1）将准备好的成熟卵母细胞加入已获能的精子悬液中，每400 μl液滴中含10～40个卵母细胞，温箱孵育12小时后即可完成受精。

（2）用口吸管将受精后的卵母细胞转移至M2中清洗2～3次。