异种体外受精实验模型的建立

互联网2012-09-24

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异种体外受精是将不同种动物的雌雄配子模拟体内条件混台培养使其融合受精的一项生物高技术。通常采用金黄地鼠卵为雌配子与各种哺乳动物或人的精子进行实验，因此又称精子穿透试验(SPA)。人精子与地鼠卵体外受精结果与人同种体外授精呈高度正相关系。

可取代人卵用来检测人精子的受精能力。SPA可反映精子获能、顶体反应精卵相互作用诸多方面的功能，因此可用于以上方面的生理学、药理学和毒理学角度的研究。目前国际上已广泛采用SPA作为不育症诊治和男性生育力鉴定技术及生殖研究的实验模型。

1.1 实验准备与操作标准

实验全程按细胞培养标准进行准备与操作业，涉及卵子的步骤在体视显徽镜监控下进行。

1.2 动物

8～12周龄金黄地鼠；纯系鼠料饲养，每日补充鲜胡萝b 20～30g/只；自然光照，光/暗时间比约为l4/10h；室温l6～3O℃。选用8～20周龄鼠用于超排卵实验。

1.3 培养液配制

采用通用的Bww培养液。配制程序参照MarLinE稍加改良。试剂均为国产分析纯，三蒸水或蒸馏去离子水配制。贮备液配方见表1，于800ml水中侬次溶入1～4；用 50ml水单独溶解 5后加入，再依次溶入6～12。此时溶液呈红色pH约 7.8。4℃贮存。2月内使用。

工作液 (BWW )配制程序：l00ml 贮备液中依次溶入碳酸氢钠210mg，葡萄糖 l00mg，乳酸钠糖浆(70 ～80 )0.325ml，人血清白蛋白350mg。用 1.0mol/LHEPES或碳酸氢钠调 pH 8.0土0.1；0.45μm和0.22μm微孔滤膜先后过滤；分装密封，4℃贮存，1周内使用。

1.4 地鼠超排卵与卵子制备

选动情周期第1天 (见阴道乳白色分泌物)雌鼠，上午8～9时腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG )30～ 40IU/只；56～61 h后注射人绒膜激素(hCG)等量；17h后断头解剖，取出输卵管放入预冷 (4℃)BWW 中，针刺腹壶部取卵并洗净；0.1 %透明质酸酶消散颗粒细胞：洗净卵子；0.05% 胰酶消化透明带并洗净。

制得卵子立即用于授精或放在甲基硅油复盖的Bww 中，4℃存放4h内使用。在1次实验中将 23只条件相似的地鼠分为2组，分别于注射 PMSG 56和 61h后注射 hCG，取卵后计数每只排卵数，比较两组排卵效果。

1.5 精液处理与精子获能

人：正常生育力青年男子按摩采集精液。液化精液用双层撩镜纸过滤；取 0.4ml精液注入 2mlBWW(于 5ml试管 )底部，37℃斜置培养1h；竖起 5 min，吸出80 %上层液即得活精子悬液。离心洗涤2遍并调整精子浓度为 l×l06/ml左右。将此悬液lml置于1.5 ml塑料离心管巾密封培养 (37℃，5h)以使精子获能。

小鼠：8～12周龄ICR小鼠，断头剖出附睾，剔净周围组织，剪下附睾尾放入0.2ml Bww中剪碎；37℃培养 5 min使精子游出；吸取精子悬液稀释至 (1～ 2)×l0ml，培养3h。

1.6 授精

去透明带地鼠卵经 37℃预培养 5min；吸取10~20颗卵子置塑料培养皿 (15mm×30mm，)中成球形小滴，注入获能精子50μL，滴上灭菌甲基硅油覆盖液面，于37℃ ，饱和湿度中培养 2～3h。

1.7 检查

授精后卵子 Bww 洗涤3遍除去贴附精子；将卵子放于4角滴有特制软蜡 (凡士林；石蜡一9：l，V：V)的载片中央，加上盏玻片(2.1mm×2.1mm)．轻压4角使卵子压扁；相差显微镜观察。卵内有膨大透亮精子头或 2个以上原核井伴精子尾判断为受精；受精率 (FR)=受精卵数/检查卵数× 100 。

1.8 重复实验与质量控制

按以上程序进行了多次重复实验。人精子16例次，小鼠精子8例次。实验质量控制采用同一精液标本在同一次实验中分成7个平行样，不同操作者平行操作，量后分别计算FR，求出均数及其变异系数 (CV)，以 CV≤l5 为合格]。