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异种体外受精

相关实验:体外受精

别名:in vitro fertilization

最新修订时间:

简介

体外受精(in vitro fertilization)是指在体外培养条件下离体哺乳动物的精子和卵子的融合过程。体外受精技术是研究胚胎早期发育、遗传和优生等的重要实验手段,已引起人们极大的重视。体外受精技术通常分为异种体外受精和同种体外受精。

原理

异种体外受精是指来自不同种类动物的精子与卵子在体外进行受精的过程。其技术原理是当透明带完整的卵与获能或未获能的异种精子混合后,精子可以结合至卵透明带,但不能穿过透明带和卵膜使卵受精。只有当卵的透明带去除后(机械或酶解去除),异种精子才表现对卵的高度亲和性,并能穿透卵膜,形成雄性原核。因而认为哺乳动物卵细胞的透明带是异种间受精的主要障碍。卵细胞透明带在正常体内受精过程中起重要作用。精、卵的种族专一性识别和结合必须发生在透明带表面的受体上,也就是说,透明带表面有特异的受体,能对精子进行专一性的识别和结合。当去除透明带后,卵细胞的种族专一性立即消失,而表现对异种精子的接受能力。

材料与仪器

器材:

① 离心机

② 血细胞计数板

③ 凹形表玻璃

④ 4 号弯针头及注射器

⑤ 眼科虹膜剪 1 把

⑥ 钟表镊 2 把

⑦ 微细吸管、小玻璃管


⑧ 蜡纸

⑨ 37 ℃ 恒温箱

⑩ 解剖显微镜

试剂:

① BWW 培养基


② 孕马血清(PMSG)

③ 人体绒毛膜促性腺激素(HCG)


④ 透明质酸酶

⑤ 胰酶

步骤

异种体外受精的基本过程可分为如下几步:

(一)试剂配制


(1)BWW 培养基原液NaCl,5.540 g;KCl,0.356 g; CaCl2 · 2H2O,0.250 g; KH2PO4,0.162 g;MgSO4 · 7H2O,0.294 g;酚红(0.5%),1.0 ml;加三蒸水至 1000 ml。

(2)BWW 培养基工作液(使用前配制)BWW 培养基原液,100 ml;NaHCO3,210 mg;葡萄糖,100 mg;丙酮酸钠,3 mg;1mol/L Hepes 缓冲液(pH7.2~7.4),2 ml;青霉素,10000 U;链霉素,1 μg;乳酸钠,37 μl;人血清白蛋白,300 mg。

(3)BWW 培养基精子获能工作液(每毫升培养基白蛋白浓度达 18 mg)BWW 培养基工作液,10 ml;人血清白蛋白,150 mg


(二)异种体外受精方法


(1)精子的制备一般采用手淫法收集 2 d 内无性生活的人体精液,放室温(25 ℃ 左右)30~60 min 使精液完全液化。然后用 8 ml BWW 培养液稀释精液,1000 g 离心 5 min,再用 BWW 培养液洗 2 次,最后用含高浓度人体血清白蛋白的 BWW 培养基调节精子数目达 1x106~1x107 个/ml。在精、卵混合之前,精子悬液应放在 37 ℃ 温箱 6 h 左右,使精子经过获能过程。一般认为,刚刚射出的精子是不能使卵子受精的,必须在雌性生殖道中孵育一段时间后,才能获得受精能力。精子在雌性生殖道中获得受精能力的过程即称为「精子获能」。很多研究者观察到体外精子在含高浓度白蛋白的 BWW 培养基孵育 6 h 左右时,精子也能获得类似于体内的获能过程,即精子绳样摆动加速、活动力增强和顶体发生反应等获能现象。


(2)卵细胞的制备。金黄地鼠卵的获取一般采用超排卵方法。成年 8~12 周龄雌性金黄地鼠于动情期第一天腹腔注射孕马血清(PMSG)25~30 U。注意勿把药物注人膀胱或肠腔。48~54 h 后,腹腔再次注射 HCG 30 U,经过 15~17 h,处死,剪开腹腔,取出输卵管。在解剖显微镜下,自输卵管伞部插入 4 号弯针头,接上注射器冲洗出包绕有卵丘细胞的成熟卵。分别用 0.1% 透明质酸酶和 0.1% 胰酶消化卵丘细胞和卵的透明带。用 BWW 培养基洗卵 2~3 次后,与精子混合。每只动物大约能获得 40~60 个卵。

(3)体外受精。取预先孵育的精子悬液 30 μl 左右放入培养皿,每个培养皿加 8~12 个无透明带的卵,然后用液体石蜡完全覆盖,或在小玻璃管内放入相同量的精、卵,用纸封口。把培养皿和小玻璃管孵育在 37 ℃ 普通温箱 3 h。但有的实验室主要用含 5% CO2 的温箱孵育。每份精液标本使用 40~60 个卵受精。

(4)精子穿透能力的估计精、卵孵育 3 h 后,用微细吸管吸出卵细胞,在 BWW 培养基中洗去附着的精子,然后把卵细胞再吸放在载片上,在解剖显微镜观察。用四周涂有凡士林的盖片轻轻挤压卵细胞,压力要轻柔、适当,以免压碎卵细胞。然后用相差显微镜观察已压扁的卵细胞浆中有无穿透的精子存在。受精的阳性结果为卵细胞浆中精子头膨大,染色质散开呈颜色较深的圆形圈,并附有精子尾部。也可把卵细胞吸放在涂有蛋白-甘油的盖玻片上,用无水乙醇-冰醋酸(3:1)溶液熏干后,再放入固定液固定 24 h 左右。然后用乙酸-洋红染色 5~10 min,蒸馏水洗 2 次后甘油明胶封片。

(三)实验结果及分析


(1)用普通显微镜观察卵细胞浆内有无染色较深、界限明显的膨大的精子头部及其附着的尾部。

(2)正常具有生育能力的男性,其精子受精率为 100 个卵中有 15~100 个卵受精,即受精率为 15%~100%;而不育症患者,其精子受精率低于 14%。

注意事项

(1)实验方案中要消毒严密,防止污染。

(2)BWW 培养基及酶制剂通过过滤除菌,操作器皿要高压灭菌。

(3)体外受精技术既需精细的显微操作,又需特殊的化学和物理条件模拟体内的特殊微环境,这样才有利于精、卵结合。

(4)卵和精子的质量好坏是受精是否能成功的关键,因而,在用酶消化卵的透明带时,要密切观察,一旦透明带消失,要迅速吸出卵细胞,用含高浓度白蛋白的 BWW 培养基洗涤,以终止酶的继续作用,时间越快越好,以免酶解损伤卵细胞膜。

(5)选择活泼健壮、睾丸和附睾发育良好的雄性动物取精,因哺乳动物(小鼠和大鼠等)的精子易于丧失受精能力,它对外界条件反应较差,容易死亡。尤其是发育不好的动物,其精子更易损伤而不能受精。

(6)精子获能是受精技术的关键步骤。人体精子在含有高浓度人血清白蛋白的 BWW 培养基中预先孵育,6 h 左右即可获能。

(7)BWW 培养基中的丙酮酸钠、乳酸钠和葡萄糖是精子运动和获能的必需的供能物质,须在精子孵育前直接加入培养基中。因为这些物质在培养基中放置过久会影响其作用。

来源:丁香实验

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