原理
胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
材料与仪器
小鼠
明胶 PBS DMEM 马血清 L-谷氨酰胺 HEPES β-巯基乙醇 PEST LIF
培养板 离心管 水浴锅 离心机 6孔板 24孔板
明胶 PBS DMEM 马血清 L-谷氨酰胺 HEPES β-巯基乙醇 PEST LIF
培养板 离心管 水浴锅 离心机 6孔板 24孔板
步骤
一、ES培养基
在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
四、N3培养基＋bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1. PBS洗涤，加入1-2 ml 胰酶。
2. 37℃孵育5分钟。
3. 用4mlEB培养基终止胰酶活，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4. 将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5. 将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5x105/孔或6孔板1.7x106 /孔。
6. 2天后更换培养基。
五、N3培养基
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化。
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化。
1. 细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基。
2. 根据需要换液（大约每隔一天）。
3. 分化10～15天后固定细胞。
4. 移除培养基。
5. PBS洗涤，加入4%福尔马林，室温放置30分钟，PBS洗涤2次储存于PBS。
6. 长期储存使用含0.01%叠氮化纳的PBS。
六、移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10 cm的培养皿。
1. 将胚状体转移至一15 ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
2. 去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1xPBS中。
2. 离心3分钟。
3. 去除上清加入1x胰酶（10 cm的培养皿加1 ml）。
4. 37℃水浴5分钟。
5. 加入5 mlEB培养基小心吹打约10次。
6. 小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
6. 小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
7. 离心2分钟。
8. 吸出上清将细胞重悬于500 ul EB培养基。
9. 用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次。
10. 离心2次。
11. 吸出上清将细胞重悬于100 ul EB培养基。
七、烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
1. 准备一10 ug/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）。
2. 加入1 mg（你能称到的最小量）到5 ml EB培养基（制成200 ug/ml）。
3. 将溶液稀释成10 ug/ml （100 ul 200 ug/ml 溶液和1.9 ml EB培养基）。
4. 如前所述将细胞重悬于2 ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液。
5. 将悬液置于室温（或冰上）30分钟。
6. 离心2分钟。
7. 吸出上清将细胞重悬于2 ml EB培养基。
8. 重复一次。
9. 离心2分钟。
9. 离心2分钟。
10. 吸出上清将细胞重悬于100 ul EB培养基并置于冰上。
注意事项
1.需要采用高纯度的水进行培养细胞。
2. 必须要在无菌的环境下操作实验。
常见问题
1. 在没有添加LIF的条件下，培养在饲养层上的ES细胞克隆形成率和AKP染色阳性度显著高于无饲养层培养的ES细胞。
2. 在LIF添加量达到l000IU/ml时，外源LIF与饲养层产生的基质型LIF在维持未分化状态作用中存在有主从关系。
3. 当没有外源LIF或量不足时，饲养层产生的分化抑制作用才会在分化抑制中发挥主要作用。
来源：丁香实验
