用Hirt法提取法抽提染色体外游离DNA

 

病毒感染宿主细胞后常常存在一些非整合的线形或环状双链DNA分子，通常称为赫特（Hirt）DNA。

下面是一个试剂盒的步骤：

GENMED 赫特（HIRT）法病毒DNA 纯化试剂盒

1． 准备 个 孔细胞培养板的细胞（不同试剂盒的具体用量不一，说明书中有具体流程）
2． 抽掉 孔细胞培养板里的 孔培养液
3． 轻轻沿壁加入 毫升GENMED 清理液（Reagent A），清洗生长的细胞表面
4． 小心抽掉清理液
5． 加入 微升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
6． 放进 ℃培养箱孵育 分种
7． 手击振动培养瓶，使细胞脱落，然后加入 毫升用户自备的完全细胞培养液
8． 移入 毫升离心管
9． 放进微型台式离心机离心 秒，速度为 g（或 RPM，例如eppendorf 5415）
10．小心抽去上清液
11．加入 微升GENMED 赫特液（Reagent B），混匀
12．加入 微升GENMED 酶解液（Reagent C），轻轻混匀
13．放进 ℃恒温水槽孵育小时
14．加入 微升GENMED 盐析液（Reagent D）
15．放进 ℃冰箱里孵育 小时或过夜
16．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为 g（或 RPM，例如eppendorf 5415）
17．移出 微升上清液到新的毫升离心管
18．加入 微升GENMED 抑酶剂（Reagent E）
19．放进 ℃恒温水槽孵育分钟
20．移出 微升（二分之一内容物）到另一个新的毫升离心管
21．分别加入 微升GENMED 萃取液（Reagent F）
22．涡旋震荡仪上强烈震荡秒
23．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为 g（或 RPM，例如eppendorf 5415）
24．分别移出上层液相溶液到新的毫升离心管，留下 微升相位交界面的溶液
25．分别加入 微升GENMED 浓缩液（Reagent G）
26．分别加入 毫升GENMED 沉淀液（Reagent H）
27．涡旋震荡仪上强烈震荡秒
28．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为 g（或 RPM，例如eppendorf 5415）
29．小心抽掉上清液
30．分别加入 毫升GENMED 净化液（Reagent I）
31．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为 g（或 RPM，例如eppendorf 5415）
32．小心抽掉上清液
33．空气中晾干
34．分别加入 微升GENMED 溶解液（Reagent J）
35．合并 管为 管离心管