SDS-蛋白酶K-苯酚抽提质粒DNA

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法的实验原理是在SDS和EDTA溶液中，蛋白酶K消化细胞蛋白质，由SDS破坏核膜而使DNA释放入水溶液。

其中 EDTA鳌合Ca2＋、Mg2＋等金属离子，抑制DNA酶对DNA的降解作用，SDS还可破坏细胞膜上的脂肪和蛋白，并与蛋白质结合成为复合物使蛋白质变性而沉淀下来。

酚-氯仿-异戊醇可使蛋白进一步沉淀，使DNA纯化。大分子DNA在乙醇中会析出絮状物，以无菌玻璃棒或塑料棒搅拌缠绕将DNA挑出、在70％ 乙醇中漂洗脱盐，真空干燥后溶解在TE中。

此分法制备的DNA大小一般为40～150 kb。如制备更大的基因组DNA，则需用完整细胞基因组DNA的低熔点胶包块法，可得1000 kb左右的基因组DNA。

器材：

①15 ml试管、1.5 ml Eppendorf 离心管

②匀浆器、1 ml可调加样器、5 μl加样器

③水浴箱、低温高速离心机、紫外分光光度计

试剂：

①材料：新鲜组织、培养细胞、血等DNA来源

②预冷的PBS缓冲液、DNA消化缓冲液、TE缓冲液、GTE缓冲液、红细胞裂解缓冲液、TNES缓冲液（血液提取用）

③酚-氯仿-异戊醇、酚-氯仿、3 mol／L乙酸钠、NaCl饱和液、0.2 mol／L NaOH（内含1％SDS）、乙酸钾溶液（pH4.8，质粒提取用）、双蒸水

④20mg／ml的蛋白酶K、0.25％ 胰酶、（质粒提取用）

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法提取质粒DNA的基本过程可分为如下几步：

（1）培养细菌将带有质粒pUC19或pBR322的大肠杆菌接种在LB琼脂培养基上或液体培养基，37℃ 培养24～48 h。

（2）用牙签挑取平板培养基上的菌落，放入1.5 ml Eppendorf离心管中，或取液体培养菌液1.5 mL置于Eppendorf小管中，10000 g离心1 min，去掉上清液。

加入150 μl GTE缓冲液。充分混匀，在室温下放置10 min溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须在使用时新配制溶液。

使用EDTA是为了去除细胞壁上的Ca2＋，使溶菌酶更易与细胞壁接触。

（3）加入200 μl新配制的0.2 mol／L NaOH（内含1％ SDS）。加盖，颠倒2～3次，使之混匀。冰上放置5 min（SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性）。

（4）加入150 μl冰冷的乙酸钾溶液（pH 4.8）。加盖后颠倒数次使混匀，冰上放置15 min。

（5）用台式高速离心机，10000 g离心5 min，上清液倒入另一干净的离心管中（乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物，在冰上放置15 min是为了使沉淀完全。如果上清液经离心后仍浑浊，应混匀后再冷却至0℃并重新离心）。

（6）向上清液中加入等体积酚-氯仿（1：1，体积比），振荡混匀，10000 g离心2 min，将上清液转移至新的离心管中。

（7）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2 min；10000 g离心5 min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

（1）生物样品要防止污染，以免混入其他来源的DNA。

（2）蛋白酶K消化要好，55℃ 孵育时要不时轻轻振摇，否则蛋白质不易去除，且DNA得率低。

（3）整个实验过程中动作要轻，防止猛烈振动使DNA断裂。

（4）质粒DNA有三种形式，共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，cccD-NA），开环 DNA （open circular DNA，ocDNA）以及线状DNA。

在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中可能呈现3条区带。