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SDS-蛋白酶K-苯酚抽提质粒DNA

相关实验:DNA 提取检测

最新修订时间:

简介

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

原理

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法的实验原理是在SDS和EDTA溶液中,蛋白酶K消化细胞蛋白质,由SDS破坏核膜而使DNA释放入水溶液。


其中 EDTA鳌合Ca2+、Mg2+等金属离子,抑制DNA酶对DNA的降解作用,SDS还可破坏细胞膜上的脂肪和蛋白,并与蛋白质结合成为复合物使蛋白质变性而沉淀下来。


酚-氯仿-异戊醇可使蛋白进一步沉淀,使DNA纯化。大分子DNA在乙醇中会析出絮状物,以无菌玻璃棒或塑料棒搅拌缠绕将DNA挑出、在70% 乙醇中漂洗脱盐,真空干燥后溶解在TE中。


此分法制备的DNA大小一般为40~150 kb。如制备更大的基因组DNA,则需用完整细胞基因组DNA的低熔点胶包块法,可得1000 kb左右的基因组DNA。

材料与仪器

器材:


①15 ml试管、1.5 ml Eppendorf 离心管


②匀浆器、1 ml可调加样器、5 μl加样器


③水浴箱、低温高速离心机、紫外分光光度计


试剂:


①材料:新鲜组织、培养细胞、血等DNA来源


②预冷的PBS缓冲液、DNA消化缓冲液、TE缓冲液、GTE缓冲液、红细胞裂解缓冲液、TNES缓冲液(血液提取用)


③酚-氯仿-异戊醇、酚-氯仿、3 mol/L乙酸钠、NaCl饱和液、0.2 mol/L NaOH(内含1%SDS)、乙酸钾溶液(pH4.8,质粒提取用)、双蒸水


④20mg/ml的蛋白酶K、0.25% 胰酶、(质粒提取用)


⑤预冷无水乙醇、预冷75% 乙醇

步骤

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法提取质粒DNA的基本过程可分为如下几步:


(1)培养细菌将带有质粒pUC19或pBR322的大肠杆菌接种在LB琼脂培养基上或液体培养基,37℃ 培养24~48 h。


(2)用牙签挑取平板培养基上的菌落,放入1.5 ml Eppendorf离心管中,或取液体培养菌液1.5 mL置于Eppendorf小管中,10000 g离心1 min,去掉上清液。


加入150 μl GTE缓冲液。充分混匀,在室温下放置10 min溶菌酶在碱性条件下不稳定,必须在使用时新配制溶液。


使用EDTA是为了去除细胞壁上的Ca2+,使溶菌酶更易与细胞壁接触。


(3)加入200 μl新配制的0.2 mol/L NaOH(内含1% SDS)。加盖,颠倒2~3次,使之混匀。冰上放置5 min(SDS能使细胞膜裂解,并使蛋白质变性)。


(4)加入150 μl冰冷的乙酸钾溶液(pH 4.8)。加盖后颠倒数次使混匀,冰上放置15 min。


(5)用台式高速离心机,10000 g离心5 min,上清液倒入另一干净的离心管中(乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物,在冰上放置15 min是为了使沉淀完全。如果上清液经离心后仍浑浊,应混匀后再冷却至0℃并重新离心)。


(6)向上清液中加入等体积酚-氯仿(1:1,体积比),振荡混匀,10000 g离心2 min,将上清液转移至新的离心管中。


(7)向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀,室温放置2 min;10000 g离心5 min,倒去上清乙醇溶液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。


(8)加0.5 ml 70% 乙醇,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或室温自然干燥。待用(可以在-20℃保存)。

注意事项

(1)生物样品要防止污染,以免混入其他来源的DNA。


(2)蛋白酶K消化要好,55℃ 孵育时要不时轻轻振摇,否则蛋白质不易去除,且DNA得率低。


(3)整个实验过程中动作要轻,防止猛烈振动使DNA断裂。


(4)质粒DNA有三种形式,共价闭环 DNA(covalently closed circular DNA,cccD-NA),开环 DNA (open circular DNA,ocDNA)以及线状DNA。

在电泳时,同一质粒如以cccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度快,因此在本实验中,自制质粒DNA在电泳凝胶中可能呈现3条区带。

来源:丁香实验

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