SDS-蛋白酶K-苯酚抽提培养细胞DNA

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法的实验原理是在SDS和EDTA溶液中，蛋白酶K消化细胞蛋白质，由SDS破坏核膜而使DNA释放入水溶液。

其中EDTA鳌合Ca2_＋、Mg2_＋等金属离子，抑制DNA酶对DNA的降解作用，SDS还可破坏细胞膜上的脂肪和蛋白，并与蛋白质结合成为复合物使蛋白质变性而沉淀下来。

酚-氯仿-异戊醇可使蛋白进一步沉淀，使DNA纯化。大分子DNA在乙醇中会析出絮状物，以无菌玻璃棒或塑料棒搅拌缠绕将DNA挑出、在70％ 乙醇中漂洗脱盐，真空干燥后溶解在TE中。

此分法制备的DNA大小一般为40～150 kb。如制备更大的基因组DNA，则需用完整细胞基因组DNA的低熔点胶包块法，可得1000 kb左右的基因组DNA。

器材：

①15 ml试管、1.5 ml Eppendorf 离心管

②匀浆器、1 ml可调加样器、5 μl加样器

③水浴箱、低温高速离心机、紫外分光光度计

试剂：

①材料：新鲜组织、培养细胞、血等DNA来源

②预冷的PBS缓冲液、DNA消化缓冲液、TE缓冲液、GTE缓冲液、红细胞裂解缓冲液、TNES缓冲液（血液提取用）

③酚-氯仿-异戊醇、酚-氯仿、3 mol／L乙酸钠、NaCl饱和液、0.2 mol／L NaOH（内含1％SDS）、乙酸钾溶液（pH4.8，质粒提取用）、双蒸水

④20 mg／ml的蛋白酶K、0.25％胰酶（质粒提取用）

SDS-蛋白酶K-苯酚抽提法提取培养细胞DNA的基本过程可分为如下几步：

（1）悬浮细胞（106个以上）离心（1500 gx5 min，4 ℃），弃上清液。贴壁生长细胞先用胰酶消化。

（2）细胞用冰冷的PBS重悬，在同样条件下离心，弃上清液，收集细胞。

（3）重复1次步骤（2）。

（4）加入DNA消化缓冲液消化，再加入20 mg／ml的蛋白酶K5μl，翻转混匀（动作轻），55℃ 水浴1h。

（5）加入等体积酚-氯仿-异戊醇，慢慢旋转混匀，倾使两相接触面积增大。

（6）4℃ 离心（10000 gx10 min）。

（7）小心吸取上层含DNA的水相至新管，加入1／10体积的3 mol／L乙酸钠，小心充分混匀，再加2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃ 放置30 min以上。

（8）4℃ 离心（12000 gx15 min），弃上清液，预冷的75％ 乙醇约1ml洗涤沉淀。

（9）4℃ 离心（12000 gx5 min），弃上清液，室温干燥约10 min（不必完全干燥，否则难溶）。

（1）生物样品要防止污染，以免混入其他来源的DNA。

（2）蛋白酶K消化要好，55℃ 孵育时要不时轻轻振摇，否则蛋白质不易去除，且DNA得率低。