手把手教你做好体外 DNA 重组
丁香实验团队
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在体外将两个或多个来源相同或不相同的 DNA 片段连接成新的重组 DNA 分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。
DNA 重组技术的基本程序包括：
（1）获得外源 DNA：外源 DNA 是进行 DNA 重组的目的 DNA 片段，一般采用 DNA 聚合酶链式反应 (PCR) 或逆转录-DNA 聚合酶链式反应 (RT-PCR)、基因组文库或 cDNA 文库筛选等方法获得。
（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的 DNA 分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。
（3）连接：目的 DNA 片段和适当载体的连接, 一般采用核酸内切酶分别消化 DNA 片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组 DNA 分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。
（4）转化：将连接的重组 DNA 产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。
（5）克隆化：重组 DNA 分子转化大肠杆菌后，在平板培养基上筛选出单个菌落，此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组 DNA 分子的单克隆。
下面以质粒为例图示 DNA 体外重组的基本程序：
一、基因组 DNA 的制备
【实验目的】
1． 理解生物细胞基因组 DNA 制备方法的原理。
2． 熟悉组织细胞基因组 DNA 制备的基本操作。
【实验原理】
在阴离子去污剂（SDS-十二烷基硫酸钠）以及酚/氯仿/异戊醇作用下可以使细胞膜破坏，核蛋白质变性，将染色体 DNA 分离出来。
【实验对象】
新鲜哺乳动物组织或细胞。
（一）从哺乳动物组织中提取基因组 DNA
【实验试剂与器材】
1. 消化缓冲液：100 mM NaCl，10 mM Tris.Cl (pH8.0)
25 mM EDTA (pH8.0)，0.5% (w/v) SDS，0.1 mg/mL 蛋白酶 K。
2. 7.5mol/L 乙酸铵。
3. 100% 乙醇。
4. 酚/氯仿/异戊醇。
【实验方法与步骤】
1. 将新鲜组织剪成小块并立即置于液氮中冻存；
2. 将 200 mg～1 g 的组织用预冷的研钵研碎，或用锤子将其捣为细粉末，每 100 mg 组织用 1.2 mL 消化缓冲液悬浮，然后于 50℃ 摇荡温育 12~18 h；
3. 用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700×g，离心 10 min。如果样品溶解得不好，再加 1 体积不含蛋白酶 K 的消化缓冲液，重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质，重复抽提一次，将上层 (水溶液) 转移至一个新离心管中；
4. 加入 1/2 体积 7.5mol/L 乙酸铵和 2 倍体积 100% 乙醇，12 000 rpm 离心 2 min；
5. 用 70% 乙醇洗涤，晾干，沉淀用 TE 缓冲液或无菌双蒸水重新溶解, 使终浓度在约 1 mg/mL。注: 加入 0.1% 的 SDS 和 1? 滋 g/mL 无 DNA 酶的 RNA 酶，37 ℃ 温育 1 h，以除去残留的 RNA。
6. 重复步骤 4、5。1 g 细胞大约能提取到 2 mg DNA。
（二）从植物组织中提取基因组 DNA
【实验试剂与器材】
1. CTAB 抽提液：2% (w/v) CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，100 mM Tris.Cl，pH8.0， 20 mM EDTA，pH8.0，1.4M NaCl
2. CTAB/NaCl 溶液：10% CTAB，0.7M NaCl
配制方法：在 80 mL 双蒸水中溶解 4.1 g NaCl，然后缓慢加入 10 g CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，同时加热并搅拌，可加热至 65℃ 溶解，定容终体积至 100 mL。
3. CTAB 沉淀液： 1% (w/v) CTAB，50 mM Tris.Cl (pH8.0)，10 mM EDTA(pH8.0)
4. 高盐 TE 缓冲液: 10 mM Tris.Cl (pH8.0)，0.1 mM EDTA (pH8.0)，1M NaCl
【实验方法与步骤】
1. 在所需量的 CTAB 抽提液中加入 2-巯基乙醇，使终浓度达 2% (v/v)。将此溶液及 CTAB/NaCl 溶液加热至 65 ℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要 4 mL 的 2-巯基乙醇/CTAB 抽提液和 0.4~0.5 mL 的 CTAB/NaCl 溶液；
2. 用液氮 (-196 ℃) 或干冰 (-78 ℃) 冷冻匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个含有机溶剂的试管或烧瓶中；
3. 往粉碎的组织中加入预热的 2-ME/CTAB，混合使之充分湿润，于 65 ℃ 温育 10~60 min，期间不时混匀；
4. 用等体积的 24:1 氯仿/异戊醇抽提匀浆液，上下颠倒充分混合，7500×g，4 ℃，离心 5 min，回收上层水相；
5. 加入 1/10 倍体积的 65 ℃ 预热 CTAB/NaCl 溶液，上下颠倒混匀；
6. 用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，离心，回收上层水相；
7. 加入 1 倍体积的 CTAB 沉淀液，上下颠倒混匀，如果沉淀可见，继续做步骤 8，也可于 65 ℃ 温育 30 min；
8. 500×g，4 ℃，(或约 2700 rpm) 离心 5 min；
9. 移出上清，用高盐 TE 缓冲液重悬沉淀 (按每克起始材料加 0.5～1 mL)，如果沉淀很难溶解，于 65 ℃ 温育直至所有的或大部分沉淀溶解；
10. 加入 0.6 倍体积异丙醇沉淀核酸，充分混匀，7500×g，4 ℃，离心 15 min；
11. 用 75% 乙醇洗涤沉淀物，干燥，用尽可能少的 TE 或水重悬 (每克起始材料 0.1～0.5 mL)。
【注意事项】
基因组 DNA 分子量大，所有操作必须轻柔，酚/氯仿对皮肤有腐蚀作用，应该戴手套操作。
二、RNA 的制备
【实验目的】
1． 理解生物细胞中 RNA 制备方法的原理。
2． 熟悉组织细胞中 RNA 制备的基本操作。
（一）细胞总 RNA 的提取
1. 异硫氰酸胍法
【实验原理】
异硫氰酸胍法提取细胞总 RNA 是目前常用的提取方法，其基本原理是：异硫氰酸胍 (GuSCN) 是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性 RNA 酶的活性，通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总 RNA。
【实验对象】
新鲜哺乳动物组织或细胞
【实验试剂与器材】
（1）GuSCN 缓冲液：
4 M 异硫氰酸胍 (GuSCN) ，25 mmol/L 柠檬酸 (pH7.0)，0.5% 十二烷基肌氨酸钠（SLS）。配制方法：先称取 GuSCN 加少量双蒸水溶解，然后加入其余成分，65 ℃ 加热使其充分溶解，4 ℃ 保存备用。
（2）GuSCN/25 mmol/L β-巯基乙醇溶液：
将 0.36 mL β-巯基乙醇溶于 200 mL GuSCN 缓冲中，4 ℃ 保存备用。
（3）2M NaAc (pH 4.0)
（4）0.1% DEPC-H2O：将 0.1 mL DEPC 加入 100 mL 双蒸水中，室温摇晃 12~24 小时，然后 15 磅高压 15 min（注意：若用此水处理容器，可以不用高压处理）
（5）氯仿: 异戊醇 (49:1, v/v)
（6）DEPC-H2O 饱和酚：
将 DEPC-H2O 和酚 1:1 混合，室温摇晃 1 小时，然后静止使其分层，吸除水相，再加入 DEPC-H2O 重复一次，此即 DEPC-H2O 饱和酚。
（7）无水乙醇
（8）75% 冰冷乙醇
【实验方法与步骤】
（1）取离心洗涤后的 1×106 培养细胞或相当量的研磨后的组织，加入 200? 滋 l GuSCN/25 mM）-巯基乙醇溶液，剧烈震荡使细胞裂解，此时溶液变黏稠；
（2）加入下列成分：2M NaAc (pH4.0) 25? 滋 l，DEPC-H2O 饱和酚 240? 滋 l，氯仿: 异戊醇 (49:1,v/v) 50? 滋 l，剧烈震荡 10 秒钟，冰浴 15 min；
（3）4 ℃，10,000×g 离心 30 min，使其充分分层，水相应透明无任何混浊 [注：RNA 在上 层水相，DNA 和蛋白质在中间相和酚相中]；
（4）将上层水相转移至另一离心管中，加入 2.5 倍体积的无水乙醇，-20 ℃ 沉淀 30 min，4 ℃，10,000×g 离心 20 min；
（5）弃上清，加入 100? 滋 l GuSCN 缓冲液将 RNA 沉淀溶解，然后加入 200? 滋 l 无水乙醇，-20 ℃ 沉淀 30 min，4 ℃，10,000×g 离心 20 min；
（6）弃上清，用 75? 滋 l DEPC-H2O 溶解 RNA 沉淀，加入 7.5? 滋 l 2M NaAc (pH4.0)，165? 滋 l 无水乙醇，-20 ℃ 沉淀 30 min，4 ℃，10,000×g 离心 20 min；
（7）弃上清，加入 75% 乙醇 (-20 ℃)1 mL，不要混合，4 ℃，7500×g 离心 10 min；
（8）弃上清，室温自然干燥 RNA 沉淀 (注意：RNA 沉淀不能过分干燥，否则将无法使其溶解)；
（9）用 DEPC-H2O 溶解 RNA 备用。若长期保存，应将 RNA 悬于 75% 乙醇中置-20 ℃。
【注意事项】
1. 所有试剂均用 DEPC-H2O 配制；操作中要防止 RNA 酶的污染，必须戴手套，戴口罩，玻璃器皿可在烤箱中 180 ℃ 烘烤 2 h，灭活 RNA 酶，或者用新的。
2. Trizol 试剂法：原理、试剂、器材.
用 Trizol 试剂 (美国 Gibco 公司产品) 在室温下可提取 RNA、DNA 及蛋白质，具有快速方便、提取量大等优点。
【实验方法与步骤】
（1）0.5~1×107 细胞或相当量的组织，用 1 mL Trizol 试剂裂解细胞，摇动混合后室温孵育 5~10 min；
（2）加入 2 氯仿，震荡混匀 15 秒，置室温 2～3 min；
（3）10,000×g，4 ℃ 离心 15 min，将水相移至另一离心管中，加入 0.5 mL 异丙醇，混合后室温沉淀 10 min，10000×g 离心 10 min；
（4）弃上清，加入 1 mL 75% 乙醇，不混合，7500×g 离心 10 min；
（5）弃上清，室温下空气蒸发残存的乙醇。
3. Oligo(dT) 纤维素层析法提取 mRNA
【实验原理】
真核细胞的 3』端有 poly(A) 尾，因此可用 Oligo(dT) 纤维素结合 mRNA，从而将 mRNA 从总 RNA 中分离出来。Oligo(dT) 纤维素就是将 Oligo(dT)15～18 结合到纤维素上，制备成能特异性结合带 Poly(A) 尾 RNA 的纤维素。
【实验试剂与器材】
（1）Oligo(dT) 纤维素
（2）层析柱装置
（3）1×上样缓冲液：20 mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1% 十二烷基肌氨酸钠 (SLS)
配制方法: 用 Tris.HCl、NaCl 和 EDTA 母液，加入各成分确切含量后，15 磅高压 15 分钟，待溶液冷却至 65 ℃ 时，加入预先在 65℃ 水浴 30 min 的 10% SLS，至终浓度为 0.1%。也可用 0.05M 柠檬酸钠代替 Tris.HCl。然后用 0.1%DEPC 处理整个缓冲液。
（4）洗脱缓冲液: 10 mM Tris.HCl (pH7.6)，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.05% SDS
先将 Tris.HCl 和 EDTA 混合后高压，然后加 10%SDS 至所需浓度，此缓冲液配制后不可高压。
（5）3M NaAc (pH5.2)
（6）DEPC (焦碳酸二乙酯,sodium acid pyrophophate) 处理水：0.1% DEPC 双蒸水，37 ℃ 摇动温育至少 12 h，然后 15 磅高压 15 min。
【实验方法与步骤】
（1）将 0.5～1 g 的 Oligo(dT) 纤维素悬于 0.1M NaCl 溶液中，然后用 0.5~1 mL 装柱；用 3 倍柱容积的 DEPC-H2O 洗柱，再用 1×上样缓冲液洗柱，至洗出液 pH<8.0；
（2）将 RNA 溶液在 65 ℃ 加热 5 min，然后迅速冷却至室温，加入等体积的 2×上样缓冲液，混合后直接上样，并收集流出液。重复此过程 2-3 次以使 mRNA 更充分地结合到纤维素上；
（3）用 2～3 倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱 mRNA；
（4）加入 1/10 容积的 3M NaAc (pH5.2) 于 mRNA 洗脱液中，混合后加入 2.5 倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后-20 ℃ 沉淀 30 min；
（5）10000×g，4 ℃ 离心 15 min，弃上清。用 70% 乙醇漂洗，10000×g 离心 5 min，弃上清, 室温蒸发乙醇；
（6）用适量的无 RNase 污染的水溶解 mRNA。此 mRNA 可用于 Northern 印迹，RT-PCR 及核酸保护试验。若长期保存，可加入 3 倍体积的无水乙醇，置-70 ℃。
【注意事项】
（1）因为 RNA 易被 RNase 降解；整个操作不能有 RNase 的污染，同时要注意无菌操作。
（2）所有试剂的配制均用 DEPC 处理过的水
（3）加入 3 倍体积的 100% 乙醇于 RNA 溶液中，-70 ℃ 可长期保存.
（4）此 RNA 可用于第一股 cDNA 的合成，Northern 印迹，核酸酶保护试验等。
三、质粒 DNA 的制备
【实验目的】
熟悉质粒 DNA 常用的制备方法
【实验原理】
转化细胞中的质粒 DNA 制备主要包括三个步骤：细菌的培养、收获和裂解、质粒的分离和纯化。低浓度的碱和 SDS 可以有效地裂解细菌的细胞壁，从而使质粒释放出来。
【实验试剂与器材】
1. 细胞悬浮液: 50 mM 葡萄糖，25 mM Tris.Cl,（pH8.0），10 mM EDTA.Na2,（pH8.0）
2. 细菌裂解液: 0.2 mol/L NaOH，1% SDS
3. 中和液: 60 mL 5M 醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，28.5 mL 双蒸水
4. 3 mol/L NaAc (pH 5.2)
5. TE 饱和酚 (pH8.0)
6. 氯仿/异戊醇 = 24:1
7. RNase（20 mg/mL）
【实验方法与步骤】
（一）质粒的小量制备:
1. 将 5 mL LB 培养液 (含筛选抗生素) 加入到容量为 15 mL 并通气良好的试管中，然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中，37 ℃ 以 225 rpm 速度振荡培养 14-16 h；
2. 10,000 rpm，4 ℃ 离心 5 min，弃培养液；
3. 用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来，室温放置 5 min；
4. 加入细菌裂解液，上下颠倒微量离心管以裂解细菌，待溶液变黏稠为止；
5. 加入中和液，上下颠倒混合后置冰上 5 min，12,000 rpm，4 ℃ 离心 5 min；
6. 将上清移至另一离心管中 (注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的 TE 饱和酚/ 氯仿 (1:1) 混合液，振荡混匀 1 min，12,000 rpm 离心 2 min；
7. 将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1) 溶液，振荡混匀 1 min，12,000 rpm 离心 2 min；
8. 将上层水相移至另一离心管中，加入 2.5 倍体积的无水乙醇，置-20℃ 沉淀 15-30 min，然后 12,000 rpm 离心 15 min；
9. 弃上清，于沉淀中加入 100? 滋 L 双蒸水或 TE(pH8.0) 溶解沉淀，加入 20? 滋 g/mL RNase，置室温 30 min，然后加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1)，振荡混匀 1 min，12,000 rpm 离心 2 min，将上层水相移至另一离心管中，加入 0.1 倍体积 3M NaAc(pH5.2) 和 2.5 倍体积无水乙醇，置-20 ℃ 沉淀 15~30 min，然后离心 15 min；
10. 弃上清，加入 70% 乙醇 ( 注意不要混合)，12000 rpm 离心 10 min；
11. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒 DNA；
12. 用去离子水溶解质粒 DNA，-20 ℃ 保存备用。
（二）质粒的大量制备:
1. 将 5 mL 转化菌种接种于 500 mL LB 培养液 (含用于筛选的抗生素) 中，37 ℃ 以 225 rpm 速度振荡培养 12～16 小时；
2. 10,000 rpm，4 ℃ 离心 15 min 收集菌体；
3. 将细菌悬浮于 100 mL 预冷的 STE（0.1M NaCl，10 mM Tris.Cl，pH8.0，1 mM EDTA，pH8.0）中，12,000rpm 离心收集菌体；
4. 将菌体悬于 10 mL 细菌悬浮液中，再移至 50 mL 离心管中；
5. 加入 1 mL 用 10 mM Tris.Cl (pH 8.0) 新鲜配制的溶菌酶溶液 (10 mg/mL)，混合后室温孵育 30 min；
6. 加入 15 mL 新鲜配制的细胞裂解液，上下颠倒混合直至溶液变黏稠为止；
7. 加入 10 mL 预冷的中和液，上下颠倒混匀，冰浴 10 min；
8. 12,000 rpm，4 ℃ 离心 20 min；
9. 将上清通过四层消毒纱布滤入另一 50 mL 离心管中，加入 0.6 倍体积的异丙醇，室温放置 10 min，12,000 rpm，室温离心 5 min；
10. 弃上清，于沉淀中加入水和 RNase，置室温 30 min，然后用氯仿/异戊醇 (24:1) 抽提一次，于上层水相中加入 0.1 倍体积 3M NaAC（pH5.2）和 2.5 倍体积无水乙醇，-20 ℃ 沉淀 15 min，12,000 rpm 离心 15 min；
11. 弃上清，用 75% 乙醇室温洗一次，12,000 rpm，离心 10 min；
12. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒 DNA；
13. 加适量去离子水或 TE 缓冲液 (pH8.0) 溶解质粒 DNA，-20℃ 保存备用。
四、 DNA 酶切，电泳分离与片段的回收
【实验目的】
掌握常用限制性内切酶的作用特点以及使用方法。
掌握 DNA 琼脂糖凝胶电泳的操作与 DNA 片段的回收。
【实验原理】
目的 DNA 被限制性核酸内切酶水解后产生大小不同的 DNA 片段，这些 DNA 片段在一定浓度的琼脂糖凝胶电泳上可以按分子大小不同而分开，并可以用不同的方法再把这些 DNA 片段从琼脂糖凝胶上回收回来。
限制性核酸内切酶水解 DNA 的活性与酶的单位数，缓冲液的离子强度和反应温度有关。
【实验试剂与器材】
限制性内切酶
10×内切酶缓冲液
琼脂糖
（一）DNA 分子的酶切消化
【实验方法与步骤】
DNA 分子用限制性内切酶消化，通常按下列比例进行：
双蒸馏水 适量
10×内切酶缓冲液 1/10 体积
DNA 1 μg
限制性内切酶 1/10 体积 (DNA 用 1-10U)
总体积 混匀后 37 ℃ 温育 30～120 min
（二）DNA 酶切片段的琼脂糖凝胶电泳
【实验原理】
核酸在 pH 高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构，以其为介质进行电泳时，不同大小的核酸可借凝胶的分子筛作用而得以分开。用溴化乙啶染色后，在紫外灯下，可见橘红色的核酸条带。琼脂糖凝胶常制成水平平板状，电泳缓冲液覆盖在平板表面，加样后，通电进行电泳，故称为潜水式电泳。
【实验试剂与器材】
1. ５×TBE: 54 g Tris 碱，27.5 g 硼酸，20 mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，配 1 升。
2. 0.5xTBE: 取 5×TBE 作 10 倍稀释
3. 溴化乙啶液： 10 mg/mL 水
4. ６×载样缓冲液： 0.25% 溴酚蓝，40%(W/V) 蔗糖水溶液
【实验方法与步骤】
1. 铸胶 1 g 琼脂糖加 0.5xTBE 缓冲液 100 mL，在微波炉上加热融化，冷却至放在手背不觉烫手（约 50 ℃）后，倾入架有样品孔形成器（梳子）的微型水平电泳槽中。胶液固化后，倒入 0.5xTBE 至高出胶面 1～2 mm，拔出梳子，接好电源线（注意正负极）。
2. 加样 核酸样品中加入样品体积 1/6 的 6x 载样缓冲液，混匀后，用移液器加入样品孔内。
3. 电泳 接通电源，施加的电压应小于 5 v/cm，待溴酚蓝跑至适当位置时，关闭电源。
4. 染色和结果观察 向微型电泳槽内滴加溴化乙啶液，至终浓度约为 0.5 μg/mL，混匀后放置约 30 min，在 254nm 紫外灯下观察电泳结果，做好记录。
【注意事项】
1. 溴化乙啶是致癌剂，并有中度毒性，实验中要戴防水手套，不要污染环境。紫外灯下观察结果时，应戴防护眼镜。
2. 也可将溴化乙啶预先加入琼脂糖中，使浓度达 0.5 μg/mL 进行配胶。
3. 琼脂糖的浓度一般用 0.8%~1.2% , 可随欲分离核酸分子的大小作调整，分子大用低浓度凝胶，分子小用高浓度胶。分离 RNA 时要用变性胶。
（三）DNA 酶切片段的回收
【实验方法与步骤】
1. 冻融法:
（1）在 UV 灯下，用手术刀片将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下，-70 ℃ 冷冻至少 15 min，然后在 65 ℃ 水浴中使胶融化；
（2）加入等倍体积 TE-饱和酚，剧烈振荡 30 秒钟，然后-70 ℃ 冷冻 15 min；
（3）室温融化后，12,000 rpm 离心 5 min，将上层水相移至另一离心管中，用 2.5 倍体积乙醇和 0.1 倍体积 3 mol/L NaAc(pH5.2) 沉淀 DNA 片段，离心后的沉淀用 75% 乙醇漂洗一次，室温干燥 DNA，用双蒸水或 TE 缓冲液溶解 DNA 后，-20 ℃ 保存备用。
2. 低熔点琼脂糖法:
（1）在 UV 灯下，用手术刀片在待回收 DNA 片段前方挖一槽，然后用同样浓度的低溶点琼脂糖将槽填平，继续电泳至待回收 DNA 片段进入低熔点琼脂糖中；
（2）在 UV 灯下，用手术刀片将含 DNA 的低熔点琼脂糖凝胶切下，37 ℃ 水浴 10 min 至凝胶融化为止；
（3）加入等体积的 TE 饱和酚/氯仿 (1:1) 抽提，12000 rpm 离心 5 min；
（4）将上层水相移至另一离心管中，用 2.5 倍体积乙醇和 0.1 倍体积 3 mol/L NaAc(pH5.2) 沉出、75% 乙醇漂洗一次，晾干备用。
3. DNA 回收试剂盒（玻璃乳法）:
（1）在 UV 灯下，从琼脂糖凝胶上切下含 DNA 片段的凝胶，放入一离心管中；
（2）加入 3 倍体积的 6 mol/L NaI 溶液，45～55 ℃ 水浴 5～10 min 使胶完全融化；
（3）加入 10? 滋 l 玻璃乳悬液，轻弹管底混匀，然后 45～55 ℃ 水浴 5～10 min，期间每 2～3 min 混匀一次；
（4）5000 rpm 离心 30~60 秒，弃上清；
（5) 加 400? 滋 l 漂洗液（20 mM Tris.Cl，pH7.4/1 mM EDTA/100 mM NaCl 和等体积无水乙醇），轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清；
（6）再加入漂洗液，轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清，并用加样器尽量除净漂洗液，然后室温晾干；
（7）加 10~30? 滋 l 无菌双蒸水或 TE 缓冲液将玻璃乳悬浮起来，45～55 ℃ 水浴 5～10 min；
（8）10000 rpm 离心 1～2 min，回收上清备用。
【注意事项】
漂洗玻璃毛时不可用加样器上下吹打，从玻璃毛上洗脱 DNA 时则相反。
五、 载体与 DNA 片段的连接反应
【实验目的】
学习和掌握 DNA 连接酶的使用原则和基本方法
【实验原理】
DNA 连接酶可以在两个双链 DNA 分子相邻的 5'-磷酸与 3'-羟基之间形成磷酸二酯键，从而可以实现重组 DNA 分子的构建。一般在连接反应之前，DNA 分子都要进行限制性内切酶消化，使待重组的 DNA 分子具有相匹配的末端，黏性末端连接和平齐末端连接是最常用的，但不匹配的末端也可以经过修饰实现连接。
下面以质粒 DNA 为载体，介绍目的 DNA 片段与载体的连接。
黏性末端的连接涉及三种情况：①载体和 DNA 片段经双酶切后，两端具有不同的粘端，可以直接进行连接反应。②载体和 DNA 片段单酶切后，在 DNA 片段两端是互补的粘端。DNA 片段插入载体时具有正反两个方向。③平齐末端连接需要在 DNA5'-端去磷酸化，否则线性载体 DNA 分子将发生自身环化连接。
（一）5'-端去磷酸化反应
通常只对载体 DNA 分子进行 5'-端去磷酸化反应就基本可以避免自身环化连接。
【实验试剂与器材】
1. 小牛肠磷酸酶 (Calf intestine phosphatase ,CIP)
2. 10×CIP 缓冲液
【实验方法与步骤】
1. 酶切 DNA 反应，在 75 ℃ 加热 15 min 灭活酶活性；
2. 10×CIP 缓冲液和 1U CIP，混合后，37 ℃ 孵育 30～60 min，然后 75 ℃ 加热 15 min 灭活 CIP 活性；
3. 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的 DNA 片段用于连接反应。
（二）连接反应
【实验试剂与器材】
1. T4 DNA 连接酶
2. 10×T4 连接酶缓冲液
【实验方法与步骤】
反应体系：
质粒 DNA (0.5(g/? 滋 l) 2? 滋 l
DNA 插入片段 (300ng/? 滋 l) 5? 滋 l
10× 连接缓冲液 1? 滋 l
T4 DNA 连接酶 1? 滋 l
加水至总体积 10 ul
混合后置 14～16 ℃ 水浴 6～12 h。
【注意事项】
1）通常 DNA 插入片段与载体 DNA 的摩尔比为 3:1 或 2:1，需根据 DNA 分子量计算，而不取决于浓度；2）平齐末端连接时，插入片段的量要远远大于载体 DNA 的量，可以为 5:1 或更多，即使这样，连接效率仍然很低。3）有时 DNA 一端是粘端，另一端是平端，这种连接与双酶切粘端连接相似；4）不匹配末端需要连接时，首先要将末端处理成平端，然后再进行连接反应。
六、重组质粒的转化
【实验目的】
学习和掌握感受态细胞的制备方法和转化实验的基本操作。
【实验原理】
将重组质粒转入大肠杆菌的过程称为转化。转化所用的大肠杆菌需要用物理或化学方法特殊处理，使重组 DNA 分子容易进入细胞内，被处理后易于接纳 DNA 分子的细胞称作感受态细胞。下面介绍感受态细胞的制备。
【实验试剂与器材】
大肠杆菌菌株，LB 培养基，100 mM CaCl2 ，DMSO 或 2-巯基乙醇，离心机，振荡器，冰浴
【实验方法与步骤】
（一）感受态细胞的制备
1. 将大肠杆菌菌株在 LB 琼脂培养基上画线，37 ℃ 培养 12～16 h；
2. 次日从琼脂平板上取一单菌落于 2 mL LB 培养基中，37 ℃ 以 200 rpm 速度振荡培养 12～16 h；
3. 取 1 mL 上述培养物接种于 100 mL LB 培养基中，37 ℃ 以 200 rpm 的速度震荡培养直至 A600 值为 0.5～0.6 (大约 3 h)；
4. 将菌液置冰浴 10 min，然后 2,500×g，4 ℃ 离心 20 min 收集菌液；
5. 弃上清，倒置离心管 1 min 除净剩余液体，然后加入 10 mL 冰冷的 100 mM CaCl2 液悬浮细胞，冰浴 10 min；
6. 4000 rpm，4 ℃ 离心 10 min 回收细胞，弃上清，每 50 mL 原培养物再加入 2 mL 冰冷 100 mM CaCl2 溶液悬浮细胞；
7. 按每份 200? 滋 l 分装，4 ℃ 可保存 1~2 周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为 15%，置-70 ℃ 备用。
【注意事项】
大肠杆菌必须从 LB 培养基琼脂平板上获得单菌落，37 ℃ 过夜培养 12～16 h，第二天按 1～5% 接种，直至 A600 值为 0.5～0.6；
（二）重组质粒的转化
1. 将感受态细胞置冰上融化，然后加入 DMSO 或 2-巯基乙醇，混合后加入 L 连接反应液 (含重组质粒)，温和混匀，置冰上 30 min；
2. 42 ℃ 水浴 45 秒，然后迅速放回冰中 1～2 min；
3. 加入 2 mL LB 培养液，37 ℃ 轻摇荡培养 1 h；
4. 4,000×g 离心 10 秒钟，弃上清，用 LB 培养液重悬菌体；
5. 将菌液铺于含有适当抗生素的 LB 琼脂培养板上，涂匀，室温放置 20～30 min，倒置于 37 ℃ 孵箱中培养 12～16 h。
（三）转化细胞的筛选
【实验原理】
1、 蓝白筛选:
以 TA 克隆载体 pRCII 转入大肠杆菌为例。TA 克隆载体 pRCII 含有 LacZ 基因，多克隆酶切位点位于其间，当没有外源基因插入 LacZ 基因中时，LacZ 基因的启动子可使此基因编码半乳糖苷酶，从而催化底物 X-gal 发生化学反应，菌落变成蓝色；当外源基因与 pRCII 载体发生连接时，LacZ 基因失活，菌落呈白色；同时该质粒还含有氨苄青霉素耐药基因。根据此特性，白色菌落含有重组质粒。在用这种质粒进行克隆时，转化平板培养基中要加入 0.5 mM IPTG、50 g/mL 氨苄青霉素及 140 g/mL X-gal。
作为载体的质粒都含有一种或两种抗生素的耐药基因，当把这种质粒转入大肠杆菌后，此菌便获得了抵抗这种抗生素的能力。目前分子克隆所用的克隆载体多含氨苄青霉素耐药基因，所以涉及最多的是氨苄青霉素筛选。当将氨苄青霉素加入培养基中后，只有含质粒的细菌能够繁殖，而不含质粒的细菌则不能繁殖形成菌落。此种筛选不能鉴别重组质粒或自身环化的质粒。在用含氨苄青霉素耐药基因的质粒进行克隆时，转化平板培养基中要加入氨苄青霉素。
（四）质粒和菌株的保存:
1. 质粒可以在-20 ℃ 冰冻保存。
2. 菌株可在含 8～15% 甘油培养液中-20 ℃ 或-70 ℃ 保存。也可在半固体 LB 琼脂培养基中穿刺保存。
思 考 题
1． 描述体外 DNA 重组的基本过程。
2． 名词解释：质粒、限制性核酸内切酶、感受态细胞、转化、α互补。
3. 限制性核酸内切酶切割 DNA 片段后的连接需要考虑哪些问题。
4. 构建一个克隆载体的必要条件有哪些。
