DNA重组相关问题？

用高效连接酶连，400U或2000U，还可延长反应时间

还是要先确保酶切是成功的，然后回收回来的片段浓度够，连接时载体与目的基因的比例，连接酶都要保证

先保证连接酶的活性。然后连接时间，普通连接要过夜，可以试试用快连

去磷酸化后因自身5'端无磷酸基团，因而不可以和自身3'端连接。但是，载体去磷酸化后3’还是有羟基的，可以与目的片段的5'端磷酸基团连接。载体的5'端和目的片断的3’-OH不能成键，因而形成一个双链各有一个切口的双链环状DNA，双链的切口会在转化入大肠杆菌后，在复制的过程中被修复。

检查连接步骤，如果实在连不上，可以尝试其他连接方法，比如无缝克隆之类的。

你插入片段加磷酸了吗？把你插入片段进行加ATP处理可能会好一些

用NEB的高效连接酶连看看，用400U或2000U的试试，另外可以延长反应时间，16℃过夜连接或者用很长时间试试！

1、用NEB的高效连接酶连看看,用400U或2000U的试试。

2、16度过夜连接；

3、失活的方法很多了，可以加热（有的热敏感酶可以），可以直接过胶回收柱子，但比较放心的方法就是跑胶回收。