【共享】DNA重组

DNA的重组
T载体连接(T/A cloning)
(一)、试剂:
a.  外源片段DNA；
b.  pGEM®-T easy 载体或pMD18-T 载体。

(二)、流程:
a.  将pGEM®-T easy或pMD18-T离心至管底。
b.  建立以下连接体系(每次使用前切记将2×Buffer振荡混匀):
表格 14、pGEM®-T easy连接体系
成份  10µl体系  20µl体系
2×Rapid Ligation buffer
最好按照每次用量分装，避免多次冻融。  5µl  10µl
pGEM®-T  1µl  1µl
PCR 产物(含有粘性A末端)  3µl(Maximum)  8µl(Maximum)
T4 DNA Ligase(3 Weiss units/µl)  1µl  1µl
用Tip吹打混匀，室温×1h或4℃过夜
表格 15、pMD18-T连接体系
成份  10µl体系  20µl体系
2×Ligation solution I （内含buffer和连接酶）
应该按照每次用量分装，避免多次冻融。  5µl  10µl
pMD18-T  1µl  1µl
PCR 产物(含有粘性A末端)  4µl(Maximum)  9µl(Maximum)
用吸头吹打混匀，室温×1h或4℃过夜

说明:
A、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求:
表格 16、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求
PCR产物大小  反应体系最低含量要求  每µl含量
0.5kb  125ng  8.5ng~41.5ng
1kb  250ng  17ng~83ng
2kb  500ng  34ng~166ng
B、平端PCR产物加尾体系(for efficient T/A cloning):
表格 17、平端PCR产物加尾体系
成份  加入量  实用量参考
纯化的无A末端的PCR产物  1~7µl  7µl
Taq DNA Polymerase 10×
Reaction Buffer with MgCl2  1µl  1µl
dATP  终浓度0.2mM  终浓度0.2mM
Taq DNA Polymerase  5units  1µl(Takara产品)
去离子水  调整体积10µl  调整体积10µl
反应:70℃×15~30min    此步后可电泳回收，
用10µl水溶解离心，
吸取3µl(10µl体系)
或者8µl(20µl体系)
进行连接反应
吸取1~2µl和T载体
建立连接反应    可将10µl全部
用于连接反应

c.  准备转化JM109等宿主细胞，蓝白斑筛选。

粘端连接法
㈠试剂及材料:
1、 含目的基因片段的DNA。
2、 载体DNA。
3、 10×Buffer 通用buffer:
4、 限制性内切酶1和限制性内切酶2。
5、 去离子双蒸水。
6、 10×连接buffer
7、 T4 DNA Ligase（连接酶）

㈡操作程序:
1、制备目的基因片段和目的线性化载体:建立如下酶切反应2个，分别酶切目的基因和载体
表格 18、双酶切反应体系
成份  10µl体系  20µl体系
质粒DNA(+水或TE)  8µl  16µl
10×Buffer (通用Buffer)  1µl  2µl
限制酶1  0.5µl  1µl
限制酶2  0.5µl  1µl
总体积  10µl  20µl
注意：双酶切通用Buffer可以查阅试剂目录确认。
2、琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段和线性化载体（见相关实验流程）。
3、在1.5ml Eppendorf管中建立连接反应:
表格 19 粘端连接反应
成份  10µl体系  20µl体系
目的基因片段  6µundefined  13µundefined
线性化载体  2µundefined  4µundefined
10×连接Buffer  1µl  2µl
T4DNA连接酶  1µl  1µl
去离子双蒸水至总体积  10µl  20µl
16℃×12~16h 或 4℃×过夜
注意：标记有的剂量仅是示意，实际使用中以2片段中的短片段（一般为目的基因片段）与长片段（一般为线性化载体）的摩尔比为2~10:1为好。
4、将连接的重组质粒转化大肠杆菌，根据不同用途选择不同菌种制备感受态细胞（见相关实验流程）。
平-粘端连接法(定向连接反应)
㈠试剂及材料
1、 含目的基因片段的DNA；
2、 载体DNA；
3、 限制性内切酶；
4、 T4 DNA连接酶；
5、 Klenow大片段；
6、 2mM dNTP；
7、 10×Klenow buffer。

㈡操作程序
1、 制备目的基因片段和线性载体:
将载体双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收，使其两端位点不同，防止连接时自身环化。
将含目的基因片段的DNA双酶切，其中必需只有一种与载体酶切所有的酶相同；琼脂糖凝胶电泳回收。
2、 粘端连接:
目的基因片段和载体各有一匹配末端，先用T4 DNA连接酶作用12h，将其连接起来。
而另一端不匹配，无法连接。此时即形成载体连接有目的基因的开环结构。
3、 Klenow补平反应，将带有目的基因载体两端的粘性末端补平:
表格 20、Klenow补平反应体系
带目的基因的载体(0.1µg)  4µl
10×Klenow buffer  2µl
Klenow大片段  1µl
2mM dNTP  2µl
去离子双蒸水至总体积  20µl
室温2h后，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。
溶于10µl TE(pH8.0)。
4、平端连接:
再用T4DNA连接酶作用16~20h，使带有目的基因片段的载体环化。
5、将重组质粒转化感受态细胞。
6、克隆筛选鉴定重组质粒。