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DNA重组与转化

互联网2013-11-13

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实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12~16℃，连接12~16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体。该载体由pUC18 载体改建而成，在pUC18 载体的多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR 产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA 酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。

由于本载体以pUC18 载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18 载体相同的功能。此外，本制品中的高效连接液Ligation Mix可以在极短时间内（约5分钟）完成连接反应，且此连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。当细菌处于CaCl2低渗液中，细菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如抗Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ’基因。lacZ’基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。lacZ’基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ’基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ’基因中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

实验试剂

1. LB固体和液体培养基

2. X-gal（20mg/mL）将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL，不需要过滤灭菌，每份1mL分装，避光贮存于-20℃。

3. IPTG（200mg/mL）：取1g IPTG溶于5mL双蒸水，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20℃。

4. 氨苄青霉素（Amp 100mg/mL）

5. pMD18-T Vector（TaKaRa连接试剂盒）

pMD18-T Vectoundefined1（50 ng/μL）

Control Insert（50 ng/μL）

Ligation Miundefined

30 μL×5 支~K~Ha~M~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~0~K~Htd~M~2~1~0~0~0~0~K~Htr~M~2~1~0~0~0~K~Htbody~M~2~1~0~0~K~Htable~M~2~1~0~K~Hdiv~M~2~1~0~Kdiv~M~2~1~0~0~Ka_name~L~4goto~Scontent~Sreagent~4~M注意：_使用时请于冰中融解。

6. 玻璃涂棒

7. 培养皿（ф9cm）

8. 吸嘴（枪头）

9. 小指管（离心管）

实验设备

1. 超净工作台

2. 恒温培养箱

3. 恒温摇床

4. 台式离心机

5. 高压灭菌锅

6. Micro Cooler

实验步骤

1. 在微量离心管中配制下列DNA 溶液，全量为5 μL。

pMD18-T Simple Vectoundefined1（50 ng/μL）	0.5μL
Insert DNundefined2 （0.1 pmol～0.3 pmol）	3μL
ddH₂ O up to 5 μL
Ligation Miundefined	5μL
总体积	10μL

取0.5μL可得到满意的结果。实际操作时，可按需要确定载体的使用量。pMD18-T Simple Vector 1μL（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。

在进行克隆时，Vector DNA 和Insert DNA 的摩尔比一般为1：2～10。

2. 16℃连接反应30min。（注意：室温25℃也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。5min也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。长片段PCR产物（2 kb以上）进行DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。）

3. 含有X-gal、IPTG、的LB琼脂平板培养基的制备：每块平板约20mL固体培养基（融化状态下加入20μL100mg/mL Amp），在预制的LB琼脂平板上，加40μL 20mg/mL X-gal和4μL 200mg/mL IPTG溶液，用灭菌的玻璃推棒均匀涂布于凝胶表面。（避光吸收）
4. 实验组：将5μL连接产物加入至200μLDH5α感受态细胞中，冰中放置30min。
阳性对照组：将2μL质粒加入至200μLDH5α感受态细胞中，冰中放置30min。

5. 42℃加热45s后，再在冰中放置1min。
6. 加入800μLLB液体培养基，37℃振荡培养60min。

7. 4000r/min离心5min，去掉800μL上清，混匀菌液，用灭菌玻璃推棒涂布于含有X-gal、IPTG、Amp 的LB琼脂平板培养基上，37℃正置吸收30min。

8. 倒置平皿37℃培养过夜（12～16h）。在含有X-gal、IPTG、Amp 的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。

9. 计数白色、蓝色菌落。挑选白色菌落，可使用菌落PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。

注意事项

1. 连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。

2. DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

3. 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

4. 连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。

5. 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。

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