蛋白复性（二）-基因重组蛋白质的体外复性
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关键词 重组蛋白 包涵体 复性 二硫键
到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有4000多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占90%以上，尽管基因重组技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，然而人们在分离纯化时却遇到了意想不到的困难，即这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包涵体形式存在，重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1~3.0μm的固体颗粒[1]。自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来，人们就一直期望得到高活性、高产量的重组蛋白。不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性，因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋白质的正确折叠，获得生物活性，近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。
包涵体形成的原因
重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系，都会形成包涵体[2]。主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的[3]。
1、 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
3、 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
5、 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
减少包涵体形成的策略
1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。
2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。
3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。
包涵体的分离及溶解
对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离，接着，包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。
包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸[9]，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2 、Fe3 等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应[10]。
蛋白质的折叠机理
包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构[11]。然而在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争[1]。对于蛋白质的折叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，总之，蛋白质的具体步骤可用下式描述[12、13、14]：
伸展态→中间体→后期中间体→天然态体→聚集体
在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。
提高重组蛋白质折叠复性的方法
一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少[15]。
1、 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大[16]。
2、 高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中[17]。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略[4]。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行[18]，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。
3、 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a、共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率[19]；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。f、添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质[20]。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。g、人工伴侣[21]：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。h、单克隆抗体[22]：待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。I其它：多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。jklmn
4、 液相色谱（LC）复性法：液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法，已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手段，现有报道，疏水相互作用色谱（HIC）[23]、离子交换色谱（IEC）[24]、凝胶排阻色谱（SEC）[25]、亲和色谱（AFC）[26]已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：在进样后可很快的除去变性剂；由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；便于回收变性剂，降低废水处理成本。4种色谱法，SEC的分离效果是LC中最差的，盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来，AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，HIC是其中较为理想的。变性蛋白在HIC上的复性机理为：当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC系统后，由于变性剂在柱子上的作用力较弱，变性蛋白质的作用力较强，变性剂首先同变性的蛋白质分离，随流动相一起流出色谱柱，又因HIC固定相能提供较常法高出十至数百倍的能量，在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的小分子，而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构，接着形成折叠中间体，随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附，并在此过程中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱柱。HIC固定相是从高盐溶液中吸附变性蛋白质，且与变性剂瞬时分离，不仅大大降低了蛋白质间的聚集作用，还因固定相在分子水平上为变性蛋白提供里很高的能量，使水化的变性蛋白质瞬时失水，并形成局部结构以利于蛋白质从疏水核开始折叠。HIC在蛋白质复性的同时还能与其它杂蛋白进行很好的分离，且HIC柱便宜、快速，故有很好的发展潜力。
5、 反胶束复性法[27]：由于蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，由于这样可使蛋白质相互分离，减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用，通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂，可使变性蛋白质复性，但表面活性剂对蛋白质具有变性作用。
6、 双水相复性法[15]：Forciniti用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统使得包涵体的溶解与蛋白质的折叠复性在一步双水相技术操作中完成。由于PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用，这样正确折叠的蛋白质会不断进入到另一相中，直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。
蛋白质知道如何折叠，但我们对蛋白质折叠和聚集的机制尚不十分清楚，每种蛋白质都有自己特有的折叠方式和途径，因此对某种蛋白质的复性必须反复试验，利用折叠和聚集的知识建立相对优化、适合生产规模的方法。
参考文献
[1]Lilie H, Schwarz E, Rudolph R.Advances in refolding of proteins produced in E.Coli . Curr Opin Biotechnol,1998,9(5):497-501
[2]Gribskov M, Burgess RR. Overexpression and purification of the sigma subunit of E.coil RNA polymerase. Gene,1983,26:109
[3]Lilie H, Schwarz E, Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E.coli. Curr Opin Biot,1998,9:442
[4]Xie Y, Wetlaufer D B. Control of aggregation in protein refolding: the temperature-leap tactic. Protein Sci,1996,5(3):517-523
[5]Georgious G, Valax P.Expression of correctly folded protein in E.Coli. Curr Opin Biotechnol,1996,7(2):190-197
[6]Rudolph R,Bohm G, lilie H, et al. Folding proteins. In:Creighton T E ed. Protein Function: A Practical Approach, 2nd.New York: IRL,1997,57-99
[7]CowleyDT, MackinRB. Expression, purification and charaterization of recombinant human proinsulin. FEBS Lett,1997,402:124
[8]Kuruez I,Titus JA, Jost CA. Correct disulphide pairing and efficient refolding of detergent-solubilized single chain Fv proteins from bacterial inclusion bodies.Mol Immunol,1995,12:1443
[9]Stockel J, Doring K, Malotka J. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimer classⅡ major histocompatibility complex molecular. Eur J Biochem,1997,248:684
[10]Builder S, Hart R, Lester P,et al. Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I. US patent,PN 5 663 304,1997-09-02
[11]Zhao Qin-yi.Irreversible Thermodynamic Theory for Protein Folding and Protein thermodynamic Structures. Prog.Biochem Biophys,2001,28(3):429-435
[13]Kiefhaber T, Rudolph R,Kohler H-H et al. Protein aggregation in vitro and in vivo:a quantitative model of the kinetic competition between folding ang aggregation. Biol Technology,1991,9:825-2-829
[14]Yeh Sih, Rousseau D. Folding intermediates in cytochrome c. Natu Stru Biol,1998,5(3):222
[15]Creighton TE. How important is the molten globule for correct protein folding?Trends Biochem Sci,1997,22:6
[16]Forciniti D. Protein refolding using aqueous two-phase systems.J Chromatography A,1994,668(1):95-100
[17]de Bernardez C E. Refolding of recobinant proteins. Curr Opin Biotechnol,1998,9(2):157-163
[18]Hevehan D L,Clark E D B.Oxidative renaturation of lysizyme at high concentration. Biotechnol Bioeng,1997,54:221-230
[19]Maeda Y, Ueda T, Imoto T. Effective renaturation of denatured antibody improve its in vivo folding.Protein Eng,1995,8:81-89
[20]Simmons T,Newhous Y M, Arnold K S et al . Human low density lipoprotein receptor fragment successful refolding of a functionally active ligand-binding domain produced in E.coli.J Biol Chem,1997,272(41):25531-25536
[21]Rozema D,Gellman S H. Artificial chaperone-assisted refolding of denatured-reduced lysizyme:modulation of the competition between renaturation and aggregation . Biochemistry,1996,35(49):15760-15771
[22]Sadana A.Protein refolding and inactivation during bioseparation:bioprocessing implications.Biotech Bioeng,1995,48(5):481-489
[23]Geng X,Chang X.J Chromatogr,1992,599:185-194
[24]Suttnar J,Dyr J E,Hamsikova E et al. J Chromatogr B,1994,656(1):123-126
[25] Werner M H,Clore G M,Gronenborn A M et al . FEBS Lett,1994,345(2-3):125-130
[26] Taguchi H,Makino Y,Yoshida M.J Biol Chem,1994,269:8529-8634
[27]Hagen A J,Hatton T A, Wang D I C. Protein refolding in reverse micelles.Biotech Bioeng,1989,35(4):955-965
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