基因重组—层析法

携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni²⁺）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

一、试剂准备
 

1.  LB液体培养基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
 

2.  氨苄青霉素：100 mg/mL。
 

3.  上样缓冲液：100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris，8M Urea，10 mM  2-ME，pH8.0。
 

4.  Washing Buffer：100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
 

5.   Elution Buffer：100 mM NaH₂PO₄，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。
 

6.   IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um滤膜抽滤，-20℃保存。

1.   接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。
 

2.  按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1 mL过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀ = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.   对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l，37℃继续培养1-3h。
 

4.  12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
 

六、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
 

1.  NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1 mL NTA介质，并分别用8 mL 去离子水，8 mL上样缓冲液洗涤。
 

2.  重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5 mL上样缓冲液， 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60 min，4℃ 12000 rpm 离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.  上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni²⁺-NTA柱，收集流出液，取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。
 

4.  洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD₂₈₀ = 0.01分步收集洗脱液，约3-4 h，取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。
 

5.  洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。