层析法介绍（一）

一、纸层析
　　　纸层析创立于1944年，和薄层层析一样，纸层析不仅可以用来分离、检识、测定中药中复杂的有效成分，而且可以于少量成分的提取精制。它是一种以滤纸上吸附的水为固定相，滤纸作为支持剂的分配层析法。纸层析应用较广，其主要用途是为分配薄层及分配柱层析摸索条件。虽然纸层析比较费时，易产生拖尾、不耐腐蚀性显色剂等，但它对水溶性或亲水性强的成分分离却有独到之处。因而，今天我们对它作以研究。

　　1．纸层析的分离原理：作为一种分配层析，纸层析是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离目的。纸层析通常多以水为固定相，滤纸为载体。点样后，先饱和，再浸入适当的展开剂中进行展开。
　　2．滤纸的选择：常用层析专用滤纸，纯净无杂质，有一定强度；同时还须质地均匀、平整无折痕，根据样品及展开剂的要求来选择下列各型滤纸：
　　（1）快速滤纸结构巯松，宜用来分离Rf值相差较大的成分。
　　（2）慢速滤纸结构致密，宜用来分离Rf值相差较小的成分。
　　（3）中速滤纸比较常用。
　　滤纸可用二甲基甲酰胺、丙二醇代替水做固定相，以分离亲脂性较强的成分；或者选择不同PH的缓冲液处理，以分离一些酸、碱性成分。
　　基本选择依据还是三相关系图。主要以被分离成分在两相溶剂中溶解度的不同，以及展开剂的极性来进行统一协调和考虑。
 
　　3．展开剂的选择：
　　用的展开剂是与水能部分相溶的有机溶剂，如用水饱和的正丁醇、正戊醇、酯等。
　　有时也向其中加入有机酸、有机碱或一定比例的甲醇、乙醇等。以增大Rf值。
　　如欲分离极性较大的成分，可在展开剂中加入适量的水、乙醇等。
　　4．纸层析的理想结果：斑点圆正、集中；被分离成分的Rf值在0.05－0.85之间；分离后各成分间的距离以Rf值计算，最好大于0.05。
　　5．纸层析的操作步骤：
　　（1）点样：将样品溶解于溶解度大且易挥发的有机溶剂。以毛细管或专业点样器　吸入样品溶液进行点样。注意常规距离：板端留2cm、样点之间留2cm。
课堂活动：演示讲解纸层析的点样方法。
　　（2）展开：层析所用容器与TLC基本相同，专用纸谱筒或大试管也被常用。
纸层析的展开方式除了TLC中的所有方式外，还可采用径向展开。详见P37。展开结束（溶剂前沿至全纸长3/4处）后，取出滤纸，用铅笔画出溶剂前沿位置（防止干燥后溶剂前沿消失）。
　　（3）显色：干燥后的滤纸，采用先看（日光下看）、再照（紫外灯下照）、再喷（需要时喷上显色剂）的步骤进行显色。注意画出斑点位置。
Rf值的计算方法与薄层层析相同。
　　（4）纸层析的应用：

　　二、柱层析：在柱型容器中进行的层析
　　一般可用材料有聚丙烯（或其它可用塑料）、有机玻璃、玻璃等做成的柱或柱型、筒形物体；内径从2cm－10cm不等，柱高等于内径的10－20倍；下端不能有吸附剂或固定相、载体流出。
　　柱层析的基本步骤：
　　1．装柱：可有湿法装柱和干法装柱等两种方法。装柱时，干法装柱与湿法装柱大同小异：吸附剂均经漏斗进入；干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，干燥的吸附剂从上端缓缓进入，前者加入空柱底，后者进入了流动相（即课本中的溶剂或者洗脱剂）。
　　装柱要领：柱层析的装柱比较重要，装柱的效果直接影响层析分离效果。因此，是制备性分离的一种基本操作技能。但是，只要做到密实均匀无气泡就大功告成。
　　小技巧：万一装柱时带入气泡，可从上端压入大量溶剂将气泡从下端挤出。
　　2．加样:又称上样或样品上柱。多将样品溶于少量的溶剂（注：柱层析所用的洗脱剂）中，小心的加入层析柱项端的平面内；也可将样品与易挥发溶剂混合后，再与吸附剂吸收、挥干挥发性溶剂后，撒布于柱的上端；有时也可用多层园形滤纸吸收样品溶液，再平放到柱的上端。
柱层析加样的基本要求是均匀薄饼样层。
　　3．洗脱：柱层析所用的溶剂，习惯上称为洗脱剂。洗脱操作的目的当然是要将加入的样品中各个组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成分。
洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收集是关键；下端烧杯定时换，薄层纸层化学检；洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。
　　经验：每30分钟－1小时内流出的洗脱剂体积等于所用吸附剂的重量为宜。
分配柱层析的特点：分配柱层析用支持剂装柱，常用的支持剂有纤维素粉、硅胶、硅藻土。装柱时先将固定相溶剂（如水或其他溶剂）加入支持剂中，搅拌混匀，再倾入的溶剂中，激烈搅拌，使两相互相饱和平衡，然后上柱。在层析柱中预先要加入已经用固定相溶剂充分饱和的流动相溶剂。铵一般湿法装柱，倒入上述处理后的支持剂，注意不断轻敲管壁，使均匀紧密，然后，放出调出柱面上的流动相。样品上柱及洗脱过程与吸附柱层析相同。分配柱层析所用的溶剂系统，可用相应的纸层析或分配薄层层析条件进行选择。