亲和层析法

　　亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，见表6�3。如抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的这种特异亲和能力又叫亲和力。
　　亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认为是激素的配体。
　　其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。
　　亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。
　　（一）固相载体的选择
　　对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。
　　（二）配体的选择
　　正确地选择合适的配体以及合适的结合方式，对获得具有优良分离效果和较大容量的载体同样具有重要作用。能与分离物质牢固、特异和可逆结合的物质都可以作为配体。选择配体有两个条件：第一是生物大分子与配体间具有合适的亲和力，亲和力太强，洗脱条件剧烈，易造成生物大分子失活，亲和力太小，解离容易，结合率不高。第二是配体要具有双重功能，既有可牢固与载体结合的基团，结合后又不影响生物大分子与配体间的亲和力。
　　亲和色谱要取得成功，配体结合在载体上并不是唯一的因素。具有同等重要的是要完全地从载体上除去非共价结合的配体。因此，应当十分认真地清洗并检查清洗的情况。
　　与载体共价偶联酶的功能团包括：
    (1)氨基：赖氨酸的ε―氨基和多肽键N末端的α－NH2。
    (2)羧基：天门冬氨酸的β－羧基，谷氨酸的α―羧基和末端的α―羧基。
    (3)酚基：酪氨酸的酚环。
    (4)羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基。．
    (5)巯基：半胱氨酸的巯基。
    (6)咪唑基：组氨酸的咪唑基。
    (7)吲哚基：色氨酸的吲哚基。
　　（三）配体与载体之间的偶联
　　实践证明，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是亲和色谱的优良载体。琼脂糖凝胶结构开放，通过性好，酸碱处理时相当稳定，物理性能也好。琼脂糖凝胶上的羟基在碱性条件下极易被溴化氰活化成亚氨基碳酸盐，并能在温和的条件下与氨基等基团作用而引入配体，亲和色谱中最为常用的琼脂糖凝胶的型号是Sepharose�4B。
　　在琼脂糖与溴化氰活化后，再与生物大分子结合形成亲和色谱填料是亲和色谱中最为常用的一种。
　　（四）使用方法
　　亲和色谱的分离方法随分离的物质不同而不同，一般的程序如下。
　　1．吸附  亲和色谱吸附剂制备好后，装入色谱柱中，色谱柱无特殊要求，常用短而粗的柱子。根据纯化物质的量、吸附能力来选择。吸附能力高的常用短柱，吸附能力弱的常用长一些的柱子。
　　样品为固体时，常用起始缓冲溶液溶解，若为液体，要通过透析等方法将溶液转换为起始缓冲溶液。上样量可根据柱子的吸附容量来推算，通常为吸附容量的1／3或更低，对于吸附力弱的物质，上样量按照1／10为佳。在样品上柱后，使用10倍柱体积的缓冲溶液将不结合的杂质清洗掉。获得最尖锐的洗脱峰和最小洗脱体积的流速为最佳流速。
　　2．洗脱  从柱中洗脱目标产物是亲和色谱是否成功的关键。通常采用降低目标产物与配体之间的亲和力的方式进行洗脱。可用一步法或连续改变洗脱剂浓度的方式将目标产品洗脱下来。当蛋白质与配体间的作用力过强时，可用一步法，甚至可先让洗脱剂在柱子中停留半小时的方法。
　　改变pH同样也能改变配体与蛋白质间的作用力，因此通过改变pH也是亲和色谱分离目标产物的一种方法。另一种方法是通过改变离子强度来洗脱目标产品。有时也用变性剂来洗脱目标产品。因此，亲和色谱分离目标产品的方法并不是一成不变的，可根据样品的性质和自己的条件进行选择。
　　对于吸附得十分牢固的生物大分子，必须使用较强的酸或碱作为洗脱剂，或在洗脱液中加入破坏蛋白质的试剂，如脲、盐酸胍。这种洗脱方式往往造成不可逆的变化，使纯化的对象失去生物学活性。因此，对于洗脱得到的蛋白质溶液应立即进行中和、稀释或透析。