亲和柱层析法
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原理
该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附，而在低盐下，碱基配对能力破坏，吸附解除，而其他成分的RNA则不具该特性，因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时，mRNA被挂在柱上，而其他RNA则随高盐溶液流出；当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。
材料与仪器
mRNA
十二烷基肌氨酸钠 EDTA NaCl Tris-HCl 洗脱液 SDS
十二烷基肌氨酸钠 EDTA NaCl Tris-HCl 洗脱液 SDS
步骤
1. DEPC处理层析柱。
2. 0.1 M NaOH处理Oliga(dT）－纤维素。
3. 用1×上样液洗柱至pH< 8.0。
4. 无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2×上样液，上样，分部收集。
5. 1倍体积1×上样液洗柱，分部收集。
6. OD260沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。
7. 2~3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。
8. 测定各收集管的OD260，将有吸光值的各管合并。
9. 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，12 000 g 离心10 min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。
10. 提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280 nm 比色，要求A. OD260%/ OD280%不小于2.0及40 μg 所提样品在OD260%的值为1 。
11. 提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8 Kb 间均匀着色，1.5-2 Kb 间着色较强。
来源：丁香实验
