层析法
最新修订时间：
原理
用层析方法纯化质粒DNA主要利用质粒DNA与初始裂解物中其他分子的物理性质的差别。核酸带负电，因此可用离子交换层析的方法进行纯化。大分子的质粒DNA可以通过凝胶过滤层析方法去除小分子杂质而得到纯化。现在许多离子交换层析纯化系统已经市场化了。因为没有一种方案适合所有的层析方法，所以用厂家所推荐的方法制备粗裂解物和装柱就尤为重要。
材料与仪器
质粒
氯仿 RNA酶
Qia滤器
氯仿 RNA酶
Qia滤器
步骤
一、粗制裂解物的制备
在制备初始裂解物时使细菌培养容量和细胞浓度与预计的DNA含量和所用柱子对质粒DNA的结合力相适合是非常重要的。过载的柱子会使系统的性能降低。而且裂解物黏度过高，需要进行强有力的混合，会导致细菌基因组DNA的剪切和随后的质粒DNA的污染。
通过层析方法制备的质粒DNA最常见的污染物是高分子质量的RNA。这种污染物通过往重悬的细胞沉淀里加人5 0 μg/ml的RNA酶A可降低。试剂同Qiagen-tip柱及包括RNA酶的5 Prime—3 Prime柱一起提供。
当粗裂解物上样到柱上时，粗裂解物中的固体物质会大大阻碍或完全阻止柱子的流动。固体物质的主要来源就是沉淀时的漂浮物。为了确保没有漂浮物，可以将上清液用干酪包布过滤，并且在离心之前加氯仿抽提；也可以再次对上清液进行离心。粗裂解物在去除蛋白质和细胞碎片后可以直接加至Qiagen-tip柱。另外，Qia滤器（Qiafilter）不需离心就可快速过滤细菌裂解物，去除蛋白质、细胞碎片甚至是小的SDS沉淀物。
二、柱容量
商用柱子有多种容量，这直接关系到培养液体积、质粒的拷贝数和细胞密度。低拷贝数的质粒和噬菌粒常需要大量的培养以获得足够的DNA。高拷贝的质粒所需的培养容量则相对小一些。而用像极限肉汤这种支持高浓度细胞生长的培养基时，培养容量也相对小一些。Qiagen提供的方法以表格的方式列举了提取不同来源的质粒推荐使用的培养体积。
柱子过载大量的裂解物会影响分离特性，导致产量和纯度下降。对于其他的大多数商业柱子来说，标准的方法是要保持大约500 ml LB培养基培养细菌的质粒在适当的拷贝数从而使柱子的质粒产量较高。
柱子过载质粒DNA并不会阻止对DNA的回收，但超出柱子容量的DNA初上柱就从柱子流过而被丢失。提高产量的方法之一是收集初次上样时从柱子流出的液体。有些柱子可通过质粒DNA的洗脱和初次流出液再上柱能够再生。只有某些柱子可以再生；需按照制造商的方法进行操作。
在制备初始裂解物时使细菌培养容量和细胞浓度与预计的DNA含量和所用柱子对质粒DNA的结合力相适合是非常重要的。过载的柱子会使系统的性能降低。而且裂解物黏度过高，需要进行强有力的混合，会导致细菌基因组DNA的剪切和随后的质粒DNA的污染。
通过层析方法制备的质粒DNA最常见的污染物是高分子质量的RNA。这种污染物通过往重悬的细胞沉淀里加人5 0 μg/ml的RNA酶A可降低。试剂同Qiagen-tip柱及包括RNA酶的5 Prime—3 Prime柱一起提供。
当粗裂解物上样到柱上时，粗裂解物中的固体物质会大大阻碍或完全阻止柱子的流动。固体物质的主要来源就是沉淀时的漂浮物。为了确保没有漂浮物，可以将上清液用干酪包布过滤，并且在离心之前加氯仿抽提；也可以再次对上清液进行离心。粗裂解物在去除蛋白质和细胞碎片后可以直接加至Qiagen-tip柱。另外，Qia滤器（Qiafilter）不需离心就可快速过滤细菌裂解物，去除蛋白质、细胞碎片甚至是小的SDS沉淀物。
二、柱容量
商用柱子有多种容量，这直接关系到培养液体积、质粒的拷贝数和细胞密度。低拷贝数的质粒和噬菌粒常需要大量的培养以获得足够的DNA。高拷贝的质粒所需的培养容量则相对小一些。而用像极限肉汤这种支持高浓度细胞生长的培养基时，培养容量也相对小一些。Qiagen提供的方法以表格的方式列举了提取不同来源的质粒推荐使用的培养体积。
柱子过载大量的裂解物会影响分离特性，导致产量和纯度下降。对于其他的大多数商业柱子来说，标准的方法是要保持大约500 ml LB培养基培养细菌的质粒在适当的拷贝数从而使柱子的质粒产量较高。
柱子过载质粒DNA并不会阻止对DNA的回收，但超出柱子容量的DNA初上柱就从柱子流过而被丢失。提高产量的方法之一是收集初次上样时从柱子流出的液体。有些柱子可通过质粒DNA的洗脱和初次流出液再上柱能够再生。只有某些柱子可以再生；需按照制造商的方法进行操作。
常见问题
1. 参考文献：Bimboim，1983； Holmes and Quigley，1981 ； Radloff et al，1967。
2. 撰稿人：J. S.Heilig，Karen L. Elbing，and Roger Brent。
2. 撰稿人：J. S.Heilig，Karen L. Elbing，and Roger Brent。
来源：丁香实验
