碱裂解法
最新修订时间：
原理
大量碱裂解方法不仅相当快捷可靠，而且可获得相当纯净的粗制DNA。煮沸法的大量制备也简单易行，但得到的DNA比较粗制。高纯度的质粒DNA可通过氯化铯/溴化乙锭平衡离心法或层析法进一步纯化粗制DNA得到。
材料与仪器
培养基 菌株
EDTA SDS 乙醇 乙酸钾 异丙醇
离心管
EDTA SDS 乙醇 乙酸钾 异丙醇
离心管
步骤
1. 往5 ml的含选择性试剂（通常是氨苄青霉素）的LB培养基或丰富培养基接种单菌落。于37°C剧烈振荡培养过夜。
2. 往2 L烧瓶中加入500 ml含有适当抗生素的LB培养基，然后加人1 ml过夜培养的大肠杆菌培养物，再于37°C培养至饱和状态（OD600≈4）。
4. 用4 ml GTE溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20 ml的高速离心管中。
5. 加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液（终浓度5 mg/ml），彻底重悬沉淀，于室温放置10 min。
6. 加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。
7. 加人7.5 ml 3 mol/L乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10 min。
8. 于4 °C，20000 g离心10 min，将上清轻轻倒人至另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。
9. 加人0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5~10 min。
10. 室温，15000 g离心10 min。弃上清，加人2 ml 70%乙醇轻轻洗涤沉淀。
11. 室温，15000 g短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。4 °C无限期保存。
2. 往2 L烧瓶中加入500 ml含有适当抗生素的LB培养基，然后加人1 ml过夜培养的大肠杆菌培养物，再于37°C培养至饱和状态（OD600≈4）。
3. 于 4°C，6000 g 离心 10 min。
4. 用4 ml GTE溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20 ml的高速离心管中。
5. 加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液（终浓度5 mg/ml），彻底重悬沉淀，于室温放置10 min。
6. 加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。
7. 加人7.5 ml 3 mol/L乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10 min。
8. 于4 °C，20000 g离心10 min，将上清轻轻倒人至另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。
9. 加人0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5~10 min。
10. 室温，15000 g离心10 min。弃上清，加人2 ml 70%乙醇轻轻洗涤沉淀。
11. 室温，15000 g短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。4 °C无限期保存。
注意事项
1. 为提髙产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度；振摇速度大于400 r/min。
2. 如果DNA要用层析法纯化，加人50 μg/ml RNA酶A以降解RNA。
2. 如果DNA要用层析法纯化，加人50 μg/ml RNA酶A以降解RNA。
来源：丁香实验
