练习2 细胞培养介绍
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原理
目的
细胞培养的评判性检查。
应用
检查常规维持的一致性；在复苏、传代、冻存前培养状况的评估；对新的或实验性
情形反应的评估；确认明显的污染物。
训练目标
熟悉不同类型和不同密度的细胞培养的外观；数码或胶片相机的使用；灭菌物品和污染物间的区别，健康的和不健康的培养物间的
区别；培养物生长阶段的评估。
监督：在观察中保持连续性，摄影可以间断。
时间：30 min
背景信息
形态学，摄影（见16.4.5节）。
示范材料或操作：细胞形态，时相对比，固定和染色，免疫染色的照片样本；适于形态学研究的培养器皿的类型，如培养皿（图8.3）、盖玻片管、载玻片室（图16.3);悬浮培养物的离心涂片机（图16.4）。
安全提示：没有特殊的安全要求。
细胞培养的评判性检查。
应用
检查常规维持的一致性；在复苏、传代、冻存前培养状况的评估；对新的或实验性
情形反应的评估；确认明显的污染物。
训练目标
熟悉不同类型和不同密度的细胞培养的外观；数码或胶片相机的使用；灭菌物品和污染物间的区别，健康的和不健康的培养物间的
区别；培养物生长阶段的评估。
监督：在观察中保持连续性，摄影可以间断。
时间：30 min
背景信息
形态学，摄影（见16.4.5节）。
示范材料或操作：细胞形态，时相对比，固定和染色，免疫染色的照片样本；适于形态学研究的培养器皿的类型，如培养皿（图8.3）、盖玻片管、载玻片室（图16.3);悬浮培养物的离心涂片机（图16.4）。
安全提示：没有特殊的安全要求。
材料与仪器
步骤
观察一系列不同密度的细胞并摄影。
设备和材料
”培养瓶或培养皿中一系列不同密度的细胞，最好是同一正常或转化细胞（例如，3T3和SV3T3，或BHK21一C13和BHKZI一PyY）的不同密度情况，包括中期（大约5()％汇合，有明显的有丝分裂）、汇合（100％的生长面积覆盖了细胞，但没有堆积）和汇合后期（细胞长成多层，如果是转化细胞就会堆积）。如果可能的话最好有低密度和高密度的悬浮细胞。
2）如果可能，最好有已污染的培养物样本（最好不要是培养皿，以避免扩散的风险）和不健康的培养物，例如，很长时间没有换液的细胞。
3）倒置显微镜，配有 4X, 10X , 20X 相差物镜和聚光器。
4）自动相机，最好是带监控器的数码相机，或带摄影目镜的胶片相机。
标准方案
l）打开显微镜电源，调节灯光强度（见方案16.1）。
2）从孵箱中取出培养物。最好在同一时间检查少量培养瓶，而不要将很多培养瓶长时间放在孵箱外。取出一对培养瓶，例如，低密度和高密度的同一细胞，或者同一细胞类型的正常和转化状态。
3）用肉眼观察每一个培养物，注意培养基的混浊度、pH是否下降或分裂中的细胞。
努力辨识单层细胞，寻找图像的特征。可以选择正常形态，例如，成纤维细胞汇合时的旋涡图案（图16.Zb,h和彩图sb）。
4）在倒置相差显微镜低倍镜下观察（4x物镜）细胞密度和细胞间相互作用的特征。
5）在中倍率（10X物镜）和高倍率（20X物镜）物镜下观察细胞的健康状态（图13.1)，聚拢的特征，单层细胞的收缩或分开。
6）观察有无污染的特征（图19.la~c）。
7）寻找有丝分裂并粗略估计发生频率。
8）给每一种培养物照相（见方案16.6)，注意培养物的细节（细胞类型，最后一次传代的时间）和细胞密度，以及任何你感兴趣的特殊特征．,
9）将培养物放回解箱．取新的培养物垂复以上步孩。
补充方案：染色（见方案16.2，方案16.3)；离心涂片（见方案16.4)．间接免疫荧光（见方案16.11）。
实验变化
l）寻找相关培养物在生长模式、细胞密度和形态学方面的差异。
2）评估细胞的健康状态。
3）有无污染的迹象？
4）细胞是否准备好换液（见13.6.2节）或传代（见13.7.1节）?
5）通过计算20X物镜视野的面积和计数每个视野中的细胞数来从化地估计细胞密度．如果使用数码相机和监控器这就会变得很简单，可以川薄膜扭盖屏幕，用记号笔给每一个细胞做标记。
6）鉴别和计数这些高倍视野中处在有杖分裂，!，的细胞。
数据
定性
l）记录所有培养物在形态学、外形和生长形式方面的观察结果
2）注意任何污染物
3）确定健康状态及其他
定量
l）记录每一个培养物的细胞密度（细胞数 / cm2）。
2）记录每一个培养物的有丝分裂指数。
设备和材料
”培养瓶或培养皿中一系列不同密度的细胞，最好是同一正常或转化细胞（例如，3T3和SV3T3，或BHK21一C13和BHKZI一PyY）的不同密度情况，包括中期（大约5()％汇合，有明显的有丝分裂）、汇合（100％的生长面积覆盖了细胞，但没有堆积）和汇合后期（细胞长成多层，如果是转化细胞就会堆积）。如果可能的话最好有低密度和高密度的悬浮细胞。
2）如果可能，最好有已污染的培养物样本（最好不要是培养皿，以避免扩散的风险）和不健康的培养物，例如，很长时间没有换液的细胞。
3）倒置显微镜，配有 4X, 10X , 20X 相差物镜和聚光器。
4）自动相机，最好是带监控器的数码相机，或带摄影目镜的胶片相机。
标准方案
l）打开显微镜电源，调节灯光强度（见方案16.1）。
2）从孵箱中取出培养物。最好在同一时间检查少量培养瓶，而不要将很多培养瓶长时间放在孵箱外。取出一对培养瓶，例如，低密度和高密度的同一细胞，或者同一细胞类型的正常和转化状态。
3）用肉眼观察每一个培养物，注意培养基的混浊度、pH是否下降或分裂中的细胞。
努力辨识单层细胞，寻找图像的特征。可以选择正常形态，例如，成纤维细胞汇合时的旋涡图案（图16.Zb,h和彩图sb）。
4）在倒置相差显微镜低倍镜下观察（4x物镜）细胞密度和细胞间相互作用的特征。
5）在中倍率（10X物镜）和高倍率（20X物镜）物镜下观察细胞的健康状态（图13.1)，聚拢的特征，单层细胞的收缩或分开。
6）观察有无污染的特征（图19.la~c）。
7）寻找有丝分裂并粗略估计发生频率。
8）给每一种培养物照相（见方案16.6)，注意培养物的细节（细胞类型，最后一次传代的时间）和细胞密度，以及任何你感兴趣的特殊特征．,
9）将培养物放回解箱．取新的培养物垂复以上步孩。
补充方案：染色（见方案16.2，方案16.3)；离心涂片（见方案16.4)．间接免疫荧光（见方案16.11）。
实验变化
l）寻找相关培养物在生长模式、细胞密度和形态学方面的差异。
2）评估细胞的健康状态。
3）有无污染的迹象？
4）细胞是否准备好换液（见13.6.2节）或传代（见13.7.1节）?
5）通过计算20X物镜视野的面积和计数每个视野中的细胞数来从化地估计细胞密度．如果使用数码相机和监控器这就会变得很简单，可以川薄膜扭盖屏幕，用记号笔给每一个细胞做标记。
6）鉴别和计数这些高倍视野中处在有杖分裂，!，的细胞。
数据
定性
l）记录所有培养物在形态学、外形和生长形式方面的观察结果
2）注意任何污染物
3）确定健康状态及其他
定量
l）记录每一个培养物的细胞密度（细胞数 / cm2）。
2）记录每一个培养物的有丝分裂指数。
常见问题
分析
1）说明细胞密度的不同
2）说明有丝分裂指数的不同。
3）比较正常和软日七细胞以及高密度和低密度细胞外观，并试解释行为上的不同。
1）说明细胞密度的不同
2）说明有丝分裂指数的不同。
3）比较正常和软日七细胞以及高密度和低密度细胞外观，并试解释行为上的不同。
来源：丁香实验
