层析法（色谱法）

层析法也称色谱法，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。
层析法是近代 生物 化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，可以根据所用两个相的状态和操作方式不同进行分类如表3-1。
表2-1 层析法的一般分类

此外，还有凝胶层析、亲和层析和高压液相层析等方法。在讨论几种常用的层析法之前，先介绍一下柱层析法的一般技术。
一、柱层析法的一般技术
1、柱层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。
2、层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到需的电离形式。
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低
3、装柱层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3 体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶液彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。
4、加样上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
5、洗脱下一步是用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。在取代扩展法中，溶剂与层析材料的相互作用比柱上的物质与层析材料的相互作用要强，于是与柱结合的分子被取代。每一个柱能结合多少物质都有一个限度（即总柱容量）。在取代扩展的情况下，当样品上柱量差不多达到总柱容量的50%时，一般尚能完全完分离。但是为了得到更好的分辨力，洗脱法更为可取。
洗脱法是最常用的方法。使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10%，溶剂与柱相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。
在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。另外，还有一个可行的方法是逐渐改充溶剂的性质，形成一个离子强度、pH 或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是
能够减少拖尾现象。
6、部分收集及分析柱的流出液可以用人工的方法收收集到一系列 试管 中或使用部人收集器。这种装置能使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。第一部分的蛋白质或核酸的含酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280nm 或260nm 的光吸收来进行连续监测。