高效色谱法

高效色谱法

如文献所述，采用基于非重力的色谱技术，如 HPLC，仅用一个小容积的柱子也可以纯化出纯度极高的抗体 [3]。尽管 未 在 本 实 验 室 操 作 ，这 种 技 术在下列情况下特别有 用 ：分 离 和 鉴 定 小 量 蛋 白 质 样 本（如 活 检 组 织 ）时 ，亲 和 结 合 能 力 必 须 被 测 定 并 用于治疗用途时；当 需 要 大 量 筛 选 样 本（如 筛 选 抗 体 ）时 ；或 者 需 去 除 抗 体 中 内 毒 素 污染时 [4]。

Josic 等 使 用 Affi-Gel Blue 柱对兔抗转铁蛋白抗血清进行了 H PLC 纯化 [3]。用小鼠腹水也得到类似的结果。在 纯 化 的 第 一 轮 ，用 反 向 NaCl 梯 度 法 ，白 蛋 白 在 0.4mol/LNaCl 时被洗脱下来 J g G 要在低得多的NaCl 浓度下才被洗脱下来，根 据 Josic 等的结果，这种处理大大增加了随后的 HPLC 柱分离能力。

Bowles 等发明了用高效轻憐灰石色谱法（high performance hydroxylapatite chromatography, HPHT) 或者 DEAE 5PW(Waters Protein Pak 公司）高效液相色谱法（HPLC)大规模纯化完整 IgG 单克隆抗体的方法 [5]。对 于 用 H P H T 从 澄 清 腹 水 中 纯 化 抗 体 ，Bowles 等将腹水进行透析、稀释并经 0. 22JLOI1 Millip0r e 滤膜过滤，然后上样到 B10Rad 公司 的 MAPS(单克隆抗体纯化系统）柱 上 ，然后用20〜300 mmol/L 梯度磷酸盐缓冲液(pH6.8) 进行洗脱，Ig G l在 大 约 250 mmol/L 的浓度下被洗脱下来。 IgG 峰（约 IOOmg) 为洗脱蛋白质总量的2 5 % 〜3 0 % 。不过 ，一 些抗体似乎显著减少柱的使用寿命，有可能因为在稀释步骤抗体形成了凝集 [6]。经 H PH T 方法收集的 IgG 经过木瓜蛋白酶消化后产生Fab 片段，再 用 MAPS(单克隆抗体纯化系统）H PH T 柱上纯化并用线性磷酸盐梯度进行洗脱，Fab 片 段 在 120〜150 mmol/L 磷酸盐时被洗脱下来。 Bowles 等 也 用 DEAE 5PWHPLC 纯化出抗体并将纯化的抗体进行 SDS-PAGE 分析，发现这种方法纯化的抗体有少量的污染蛋白 [5]。
Manzke 等介绍了一种抗体大规模生产并用疏水作用 HPLC 方法进行单步纯化双特异性单克隆抗体的方法，这种方法每月可得到 8 〜12 g 的 IgG 产 量 。双特异性抗体主要被用于临床治疗，如治疗人类肿瘤，也可能用于抗病毒感染 W 。

Manzke 等使用的抗体来自于杂交-杂交瘤（tetradoma) ，这种抗体的轻链和重链分别来自于母代的两种杂交瘤细胞 (具有识别两种抗原的能力，译者注）[7]。用中空纤维生物反应器对此 tetradoma 被进行扩增培养，收获培养上清并过滤（0. 2^m) ，调 至 I.Omol/L A S 和 100 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7. 9)，再 过 滤 ，并上样于一个 8 ml 的 Phenhyi-Superose HR10/10 柱（Pharmacia)。 用 AS 梯度递减（1.0mol/L〜Omol/L 的 AS 和磷酸盐缓冲液) 洗脱抗体。此柱有效地将双特异性抗体(IgGl/IgG2a) 与来自母代杂交瘤细胞的单一独特型抗体分开，双特异性抗体在 40〜25 mmol/L A S 时被洗脱。