通 过 沉 淀 进 行 部 分 纯 化

通 过 沉 淀 进 行 部 分 纯 化
用硫酸铵沉淀蛋白质是抗体部分纯化中最古老的方法之一。将饱和硫酸铵加入血清或者腹水中来沉淀抗体。通过离心分离沉淀与未沉淀的蛋白质。当用水溶剂将沉淀重悬后 ，所得的溶液即为富含抗体的液体。
相比之下，使用辛酸沉淀，大多数沉淀的蛋白质不是免疫球蛋白。此操作结束后，抗体存在于上清中。
标准试剂的准备[如I X 磷酸盐缓冲液（PBS)]在本书其他章节已有介绍（参 见 第 8 、9、11 章）。

一、硫酸铵沉淀

1.准备一份饱和硫酸铵(AS)溶液 (4. lmol/L)(向血清或者腹水中加入等量的饱和A S 溶液，此时溶液的饱和度达到5 0 % ，抗体将会被沉淀）。

2.沉淀前，2500r/min离心腹水或血清15〜30 min，使原液澄清，将血清或腹水转入一个清洁的烧杯中，放入一个磁力搅拌子，将其放置在磁力搅拌器上搅拌。

3.加人与原液等体积的饱和A S 溶液。缓慢加人硫酸铵使其与腹水或血清混合。等出现的沉淀溶解后再加入更多的AS。当已经要基本加完所有的A S 时将会出现不溶解性沉淀。继续加完所有的AS。让溶液在 4°C继续混合6〜24 h。

4.沉淀完成后，3000 g 离 心 溶 液 30 min，弃上清（保留弃液样品作为后期的检测）。缓慢加入 150 mmol/L PBS 溶液于沉淀中，用移液枪轻柔搅拌混匀。加 入 足 够 的 PBS，其体积相当于原液的 2 5 % 〜5 0 % 。

5.将溶解的预处理抗体用 2 0 倍体积的 PBS 溶液透析。由 于 A S 的高盐浓度，建议至少 每 2 h 更换一次透析缓冲液，更 换 3 次 。

6.对终产物进行蛋白质浓度测定、区带电泳、密度扫描以及特异性检测（7. 3 节）。这些检测结果将显示抗体的纯化水平及活性。

7.纯化抗体应该小份量分装并一70℃保存。

二、辛酸沉淀

1.称量并记录腹水或血清的体积，将其转移到一个清洁的烧杯或烧瓶中。加入磁力搅拌子并放置在磁力搅拌器上搅拌。

2.加 入 2 倍体积的pH 4.0, 60 mmol/L 的乙酸缓冲液，调 节 pH 至 4.8。

3.缓慢地将辛酸(辛酸原液）滴加人腹水或血清并轻轻搅拌溶液。 10 ml 稀释后的腹水或血清中加入0.4ml 的辛酸。室温下，搅 拌 30 min。

4.5000 g 离 心10min。取出上清并保留。

5.如前所述，富含抗体的上清在保存前应该对2 0 倍体积的PBS溶液进行透析。
这些方法获得的产量不超过50% ，纯度通常也不超过70% 。因为这些方法无法产生高纯度的初制抗体，还需要进一步的纯化。策略之一是对腹水进行二次沉淀以产生中等纯度的抗体纯化物。在我们实验室，我们先进行硫酸铵沉淀，再进行辛酸沉淀。硫酸铵沉淀 后 ，抗体初提物在PBS溶液中复性，然 后 在 60 mmol/L 的乙酸盐缓冲液中透析。透析后 ，在进行辛酸沉淀前应将pH 调至 4.8。无论是通过硫酸铵沉淀，或者辛酸沉淀，或者通过两者，所得抗体都是有用的。用沉淀方法纯化的抗体能被成功应用于实验操作，如酶免疫试验、免疫沉淀、免疫印迹及斑点杂交。
经过硫酸铵或者辛酸沉淀的抗体纯度可通过区带电泳凝胶来检测（图 7. 1)。通过此分 析 ，我们通过硫酸铵（泳 道 1)、辛 酸 ，以及二者的联合沉淀步骤（泳 道 3)从腹水中纯化出单克隆抗体。单克隆抗体的浓度经A S 沉淀后由原液的16. 3 % 增加至 23. 0 % ，经二步沉淀后浓度增至32. 7 5 % 。单独应用A S 沉淀提高了单克隆抗体的浓度，但联合沉淀操作使得抗体的纯度得到了更喜人的提高。尽管如此，即使应用二步沉淀，抗体的纯度也还是只能 达 到 7 5 % 〜8 0 % 。