I g G 抗 体 的 其 他 纯 化 方 法

抗体纯化还有其他方法。最著名 的 是 分 子 筛 层 析 法（size exclusion chromatography, SEC)及离子交换层析法（ion exchange chromatography， IEC)。 对于 IEC ， 有许多阴离子交换树脂，它们作用于单克隆抗体的效果要好于多克隆抗体，因为想要纯化出最局产量的抗体就需要知道抗体的等电点（isoelectric point, pi) 。很明显，多克隆抗体的pI范围宽, 而单克隆抗体的p i 范围较窄。下面的图表显示了各种单克隆抗体亚型在使用阳离子或者阴离子交换柱纯化时，其洗脱峰时的N aCl摩尔浓度范围（图 7. 4)。



由于多克隆抗体P l范围较宽，所以用某一特定的P H 缓冲液及离子强度洗脱时，不是血清中的所有抗体都能与基质保持结合。因此，最好采用梯度洗脱体系。可对血清中洗脱的免疫球蛋白进行选择，并可将不同条件洗脱的抗体加到一起。对于某些多克隆抗体 ，其他血清蛋白可能在相同的条件下与其一同洗脱。 IE C 的主要优点是成本低。不论是阳离子还是阴离子交换树脂其费用均比蛋白质A 和 蛋 白 质 G 低 。但 与 蛋 白 质 A 和蛋白 质 G 相 比 ，这种方法纯化结果变异很大，并 且 纯 化 条 件 需 依 据 每 种 抗 体 而 确 定 。纯度范 围 为 6 0 % 〜9 5 % 。
IE C 的 最 大 的 优 点 是 它 能 精 制 备 其 他 方 法 纯 化 的 单 克 隆 抗 体 。 IE C 将 分 离 去 除 单克 隆 抗 体 中 的 蛋 白 质 A 或 蛋 白 质 G 、DNA、逆 转 录 病 毒 及 内 毒 素 。所 得 的 单 克 隆 抗 体纯 度 可 被 认 为 > 9 9 % , 这 对 制 备 用 于 动 物 实 验 和 临 床 试 验 的 单 克 隆 抗 体 具 有 很 大价 值 。
SEC 是 蛋 白 质 纯 化 中 最 古 老 的 技 术 之 一 ，同 时 也 是 一 种 温 和 的 方 法 ，因为可用生理条 件 下 的 缓 冲 液 将 抗 体 在 最 适p H 中 进行纯化。一 些 制 造 商 生 产 多 种 树 脂 。对 于 抗 体 ，葡 聚 糖 凝 胶（Sephadex）G150、G200、G300（Pharmacia/Pfizer）是 常 用 的 树 脂 。数 值 体 现在 颗 粒 的 孔 径 度 上 ，数 值 越 高 ，表明孔径越大。大 分 子 不 进 入 胶 孔 内 先 流 出 ，因此它穿过柱子的速度要比小分子快。小分子在流经孔径时因被阻止而进人基质所以比大分子后洗脱 下来。
经 过 蛋 白 质 A/G 纯 化 后 ，可 能 会 有 一 些 脱 落 的 蛋 白 质 A/G 、细 胞 来 源 的 DNA、小的抗体片段及大的蛋白质聚集体。在 蛋 白 质 A/G 纯 化 后 ，可 用 SE C 去除抗体 制 品 中 的 这
些 少 量 成 分 ，使得其浓度几乎> 9 9 % 。 SEC 也可 以 作 为 分 析 抗 体 制 品 纯 度 的 一 种 廉 价 手
段 。在一个小柱子中加入少量的浓缩抗体就能够以色谱方式显示抗体的纯度和杂质的分子 大 小 ，所得结果与高效液相相近。
依 据 所 准 备 的 SEC 柱 种 类 不 同 ，柱子的最大上样量与柱宽和柱高有一个最低限度的绝对相关性。参照下图计算柱子直径（图 7. 5)。


除 非 柱 子 的 直 径 达 2m ①以上并且柱高达几英尺，否则不能以大样本上样。依我们的经 验 ，上 柱 的 抗 体 体 积 为 整 个 柱 容 量 的 5 % 。 在 大 多 数 情 况 下 ，一 次 只 能 纯 化 几 毫 克 的
量 。因 此大量抗体的纯化是一个冗长复杂的过程。尽 管 如 此 ，S E C 仍是增加抗体产品纯度 的 有 价 值 的 方 法 ，并且也是分析最终的抗体纯度的廉价途径。