Ig M 和 Fab 抗体片段的纯化

IgM 抗体以难于纯化著称，因为它是以五聚体结构存在。要 纯 化 IgM ，需要结合盐析 及 IEC 或 者 SEC 的多步操作，这 是 纯 化 IgM 的令人满意的手段，但是对于大量的抗体 ，这种方案过于繁琐且预期的产量低。在我们实验室，我们用两种其他的亲和柱纯化IgM- 蛋白质 L 亲和层析和山羊抗鼠 IgM 抗体亲和层析。

一、 抗 鼠 I g M 抗体亲和层析

我们实验室纯化 Ig M 的首选技术是用山羊抗鼠 IgM 亲和层析柱。我们购买已经交联抗体的琼脂糖树脂并自己装柱。

二、试剂

结合缓冲液： 10mmol/L 磷酸缓冲液含 0. 5mol/L NaCU pH 7. 2

2X结 合 缓 冲 液 ： 20mol/L磷 酸 缓 冲 液 含 1mol/L NaCl,pH7.2

洗脱缓冲液： 100 mmol/L 甘氨酸含 150 mmol/L NaCl，pH 2. 4

平衡缓冲液：1.0mol/L Tris

透析缓冲液： 15 mmol/L PBS溶液,pH 7. 6

柱子的准备可按照准备蛋白质A /G 柱的程序。向干净的玻璃柱内倒人交联山羊抗一鼠 Ig M 的琼脂糖树脂。当微珠沉淀后用结合缓冲液冲洗，用几个柱容的结合缓冲液清洗匀浆。当 A280监测器显示洗脱液吸光值达水平基线时，柱子便可随时使用。尽管任何来源 的 鼠 IgM 都可上柱，我们认为培养上清要好于腹水。当用腹水作为原材料时，可见到纯 化 的 IgM 有少量的白蛋白污染。如果没有选择，那么可能有必要用 ffiC 或 者 S E C 进行进一步纯化。

三、 操作步骤

(1) 用 2X 结合缓冲液 I : 1 稀释澄清的抗体原液。只需准备当天要纯化的样本量。剩下的原液何时纯化何时稀释。

(2) 第一次上样时，我们建议加过量的抗体原液。保留从柱中流出的废液，因为其中含有抗体。这种作法的目的是确定层析柱对你所需纯化Ig M 的最大结合量。

(3) 上样后，收集并保留柱中流出的原液及第一次洗柱的液体。用结合缓冲液洗柱直到监测器返回基线为止。

(4) 用洗脱缓冲液洗脱结合的抗体。将紫外分光光度计设置〇D= 2 8 0 mn，在此波长处测定洗脱下来的抗体量 (参见「抗体浓度的测定」）。参考此浓度值，便可知道你制备的亲和柱的抗体结合量，以进行剩余的抗体纯化。

(5) 根据对原液中所含抗体量的估计，依照先前的分离程序，将所有或者一部分收集的流出液重新上柱。

(6) 用结合缓冲液洗去未结合的物质。当监测器返回基线时，直接洗脱抗体于 Tris中和缓冲液中。

(7) 当所有抗体洗脱完毕、监测器回复到基线，加结合缓冲液于柱内。当监测器达到基线时，柱子已准备好加入下一步的抗体原液。

(8) 将洗脱下来并已中和过的抗体保存于 4℃ 以便与再次纯化的 Ig M 合并。

(9) 继续上样并洗脱结合的抗体直到将所有抗体纯化完。

(10) 集中所有洗脱抗体并对 PB S溶液透析。抗体可进一步浓缩但 Ig M 有易沉淀析出的倾向。我们建议以 2〜5m g /m l 的浓度保存最终的抗体。

用山羊抗鼠 IgM 亲和层析柱进行纯化的 IgM 抗体可用凝胶电泳 [聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) 或者等电聚焦（IEF)] 来检测。在 区 带凝胶电泳上呈弥漫带型是大多数 IgM单克隆抗体的典型特 征 。 IgM 是一个大分子，分子质量约 750kDa, 有大量的糖基化位 点 。拥有这些 位 点 ，一 种 IgM 会有相当宽的电荷范 围 。 从培养上清中纯化的 IgM 抗体将不含腹水中鼠白蛋白的污染（图 7.6)