Fab片段抗体表达产物的纯化和鉴定
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实验步骤
3) 用50mmol/L pH值7.0 PBS结合缓冲液平衡上述亲和层析柱。
4) 加入步骤2中滤过的Fab片段抗体粗制品于柱中，反复循环30min至1h。
5) 加5~10ml 10mmol/L pH值6.8的PBS预洗缓冲液，洗去非特异性吸附蛋白。
6) 加入8ml 100mmol/L pH值2.7的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合的Fab片段蛋白，每管收集1ml。
7) 于收集管中加入50~80μl 1mol/L pH值9.0的TrisHCl缓冲液中和洗脱下来的溶液，置于4℃待测定蛋白含量。
8) 将含有蛋白高峰管合并，加入Amicon浓缩柱，根据商家手册离心浓缩。
2. Protein ASepharose柱层析纯化法Protein ASepharose可用于纯化来源于VH3免疫球蛋白家族的重组抗体。
2) 用50ml PBS将Protein ASepharose装成2ml柱子。
4) 用下列5倍体积量的溶液依次洗柱子：PBS、PBS0.5mol/L NaCl、0.2mol/L甘氨酸(pH值6.0)、0.2mol/L甘氨酸(pH值5.0)。
5) 用3倍柱床体积的0.2mol/L甘氨酸(pH值3.0)洗脱液洗脱，每管收集1ml，加200ml 1mol/L TrisHCl(pH值7.4)中和。
3. 金属离子亲和层析柱纯化法此方法可用于带有6个组氨酸的重组抗体。
2) 将抗体溶液对上样缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑)以4mol/L浓度透析过夜。
3) 用5ml NiNTA悬液(Qiagen，德国)填充层析柱。
6) 用清洗缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，3.5mmol/L咪唑)洗去非特异性吸附蛋白。
7) 用洗脱液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，100mmol/L咪唑)洗脱，每管收集1ml组分，共4~10ml。
