Fab片段抗体表达产物的纯化和鉴定

实验步骤

1. 抗Fab片段抗体亲和层析纯化法

1) 偶联抗人或抗鼠Fab片段抗体到Protein G Sepharose，将纯化的抗人或鼠Fab片段抗体以2mg/ml的比例与Protein G Sepharose凝胶珠溶液混合，室温旋转孵育1h。用10倍量的0.2mol/L硼酸钠(pH值9.0)洗两次，4 000r/min离心5min，用10倍量的0.2mol/L pH值9.0硼酸钠溶液，重悬凝胶珠子，加入足够量的DMP(dimethylpimelimide，Sigma公司)至终浓度为20mmol/L左右，室温旋转混合孵育30min后，离心去上清，加入0.2mol/L乙醇胺终止反应。继续在乙醇胺溶液中封闭2h，用PBS清洗数次，用PBS悬起来后制备2ml亲和凝胶柱。

2) 100ml IPTG诱导表达的Fab片段菌液，4℃ 4 000r/min离心15min。用pH值7.2的PBS 10ml悬起沉淀物，反复冻融三次，12 000r/min 4℃离心20min，取上清，过0.45μm滤膜，收集滤过溶液。

3) 用50mmol/L pH值7.0 PBS结合缓冲液平衡上述亲和层析柱。

4) 加入步骤2中滤过的Fab片段抗体粗制品于柱中，反复循环30min至1h。

5) 加5~10ml 10mmol/L pH值6.8的PBS预洗缓冲液，洗去非特异性吸附蛋白。

6) 加入8ml 100mmol/L pH值2.7的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合的Fab片段蛋白，每管收集1ml。

7) 于收集管中加入50~80μl 1mol/L pH值9.0的TrisHCl缓冲液中和洗脱下来的溶液，置于4℃待测定蛋白含量。

8) 将含有蛋白高峰管合并，加入Amicon浓缩柱，根据商家手册离心浓缩。

9) 对纯化浓缩后的Fab片段蛋白10~20μg进行SDSPAGE电泳，用12.5%聚丙酰胺凝胶，常规SDSPAGE电泳条件。对于鼠Fab片段抗体，由于轻链和重链分子量类似，故在25kD左右获一条带。对于人Fab片段抗体，如果λ链和Fd链的组合，可能获两条链，25kD左右的为Fd链，28kD左右的为λ链。

2. Protein ASepharose柱层析纯化法Protein ASepharose可用于纯化来源于VH3免疫球蛋白家族的重组抗体。

1) 用PBS浸泡Protein ASepharose。

2) 用50ml PBS将Protein ASepharose装成2ml柱子。

3) 将制备好的抗体溶液上样。

4) 用下列5倍体积量的溶液依次洗柱子：PBS、PBS0.5mol/L NaCl、0.2mol/L甘氨酸(pH值6.0)、0.2mol/L甘氨酸(pH值5.0)。

5) 用3倍柱床体积的0.2mol/L甘氨酸(pH值3.0)洗脱液洗脱，每管收集1ml，加200ml 1mol/L TrisHCl(pH值7.4)中和。

6) 将洗脱下来的抗体对PBS透析过夜。

3. 金属离子亲和层析柱纯化法此方法可用于带有6个组氨酸的重组抗体。

1) 抗体溶液制备，如从上清中收获抗体片断，10 000r/min离心15min，用PEG浓缩或用超滤膜浓缩(SterivexHV 0.45μm，Minipore公司，美国)。如从膜间隙收获抗体片断，则将菌液10 000r/min离心15min，用原菌量1/20体积的TE葡萄糖缓冲液(30mmol/L Tris pH值7.0，20%葡萄糖，1mmol EDTA)重悬沉淀，置冰浴20min，12 000r/min离心15min，重悬沉淀于1/20量的5mmol MgSO_４ 中，冰浴20min，12 000r/min离心15min。

2) 将抗体溶液对上样缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑)以4mol/L浓度透析过夜。

3) 用5ml NiNTA悬液(Qiagen，德国)填充层析柱。

4) 用50ml上样缓冲液平衡柱子。

5) 将抗体溶液加入柱中。

6) 用清洗缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，3.5mmol/L咪唑)洗去非特异性吸附蛋白。

7) 用洗脱液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，100mmol/L咪唑)洗脱，每管收集1ml组分，共4~10ml。

8) 将抗体组分对PBS透析以去除咪唑和高浓度氯化钠。

9) 用复原缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑)清洗柱子后，用上样缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.5，500mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑)平衡柱子。

4. Fab抗体的特异性鉴定

对于所获的Fab片段抗体，对某种特异性抗原的特异性鉴定，根据其所针对的抗原不同，则采用的方法也不同。主要方法有：

1) Fab片段抗体对同位素S３５标记抗原的特异性放射免疫沉淀，适用于构象依赖或非构象依赖的抗原。在此试验中，所用Sepharose 4B珠子需偶联相应的抗人或抗鼠Fab抗体，除了特异性的蛋白带外，结果通常还会出现一条70kD左右的非特异性条带。

2) 对特异性抗原的Westernblot鉴定，适用于一些非构象依赖的线性抗原。