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高效液相色谱法

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  以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法(HPLC)。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱,经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。


  由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广(样品不需气化,只需制成溶液即可)、色谱柱可反复使用的特点,在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法,已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。


  高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法;按色谱原理不同可分为分配色谱法(液-液色谱)和吸附色谱法(液-固色谱)等。
  目前,化学键合相色谱应用最为广泛,它是在液-液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上,形成的固定相称为化学键合相,不易流失是其特点,一般认为有分配与吸附两种功能,常以分配作用为主。C18(ODS)为最常使用的化学键合相。
  根据固定相与流动相极性的不同,液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法,当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法,主要用于极性物质的分离分析;当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法,主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

  在中药制剂分析中,大多采用反相键合相色谱法。

  系统组成:

  (一)高压输液系统
  由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
  1.贮液罐
  由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体,以保持输液静压差,使用过程应密闭,以防止因蒸发引起流动相组成改变,还可防止气体进入。


  2.流动相
  流动相常用甲醇-水或乙腈-水为底剂的溶剂系统。
流动相在使用前必须脱气,否则很易在系统的低压部分逸出气泡,气泡的出现不仅影响柱分离效率,还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。

  3.高压输液泵
  是高效液相色谱仪的关键部件之一,用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是:耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定,且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类,常使用恒流泵(其压力随系统阻力改变而流量不变)。


  (二)进样系统
  常用六通阀进样器进样,进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置(LOAD),此时进样口只与定量环接通,处于常压状态,用微量注射器(体积应大于定量环体积)注入样品溶液,样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置(INJECT),使定量环接入输液管路,样品由高压流动相带入色谱柱中。


  (三)色谱柱
  由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶(又称ODS柱或C18柱)、辛烷基硅烷键合硅胶(C8柱)、氨基或氰基键合硅胶等,在中药制剂的定量分析中,主要使用ODS柱。由于ODS属于非极性固定相,在分离分析时一般使用极性流动相,所以属反相色谱法。常用流动相有甲醇-水或乙腈-水等,洗脱时极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱。


  (四)检测器
  在高效液相色谱法中主要使用紫外检测器(UVD),可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型,以可变波长紫外检测器应用最广泛。检测器由光源、流通池和记录器组成,其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收,其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。

 

 

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