基因重组与基因工程
互联网
DNA的重组 DNA Recombination
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用(conjugation)：
当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞（细菌）,这种类型的DNA转移称为接合作用。
质粒：细菌染色体外的环状双链DNA分子。
可接合质粒，如 F 因子(F factor)
（二）转化作用(transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
重组DNA技术
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆（也称基因克隆或重组DNA）
应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
基因工程----实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。
目的 ：1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列 2、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)
（二） 工具酶
•限制性核酸内切酶
• DNA聚合酶I
• 逆转录酶
• T4DNA 连接酶
• 碱性磷酸酶
• 末端转移酶
• Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
Ⅱ类酶识别序列特点—
（三）目的基因（又称外源DNA）
•cDNA：经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。
•基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。
表达载体(expression vector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体
二、重组DNA技术基本原理及步骤
1、目的基因的获取
2、基因载体的选择与构建
3、目的基因与载体的拼接
4、重组DNA分子导入受体细胞
5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子（转化子）
（一）目的基因的获取
1、化学合成法
要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。
2、基因组DNA文库(genomic DNA library)
基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。
3、cDNA文库：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNA library）。
（二）克隆载体的选择
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA
载体的选择标准：
•能自主复制；
•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
•分子量小，以容纳较大的外源DNA。
（三）外源基因与载体的连接
1、粘性末端连接：
•同一限制酶切割位点连接
•配伍末端连接
2、平端连接
适用于：限制性内切酶切割产生的平端
粘端补齐或切平形成的平端
3、同聚物加尾连接
由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
4、人工接头： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。
（四）重组DNA导入受体菌：
受体菌条件: 安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态
导入方式：转化 (transformation)
转染 (transfection)
感染 (infection)
（五）重组体的筛选
1、直接选择：
抗药性标记选择
插入失活法
标志补救
分子杂交法：
原位杂交、Southern印迹
原位杂交
2、非直接选择法：免疫学方法：如免疫化学方法
酶免检测法
•重组DNA技术简单概括为： “分、切、接、转、筛”
重组DNA技术与医学的关系
（一）疾病基因的发现与克隆
（二）生物制药
（三）基因诊断
（四）基因治疗
（五）遗传病的预防
小 结
自然界基因转移伴发重组的形式有多种。
细菌的基因转移包括接合、转化、转导作用等，在这些过程中不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。
• 重组DNA（基因克隆）技术是应用酶学的方法, 在体外将目的基因与载体DNA接合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子，经扩增提取获得大量同一DNA分子。
• 重组DNA技术的基本过程可概括为“分、切、接、转、筛”。
