基因重组中涉及到的各种方法一览

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DNA重组 是整个基因工程中的关键，其中所涉及到的主要反应，以及每个步骤中溶液的配制数据等不少，本文对其中的质粒提取鉴定、分子杂交、基因转移、DNA制备等实验方法作详细介绍。

一、质粒 DNA的提取及鉴定

(一)质粒 DNA的提取及鉴定

1.收获细菌

(1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。

(2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机 于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。

(3)吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

2.碱裂解法小量抽提质粒

(1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中，剧烈振荡。

(2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS)，缓和振荡，水浴5min。

(3)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)，缓和振荡，冰浴5min。

(4)4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。

(5)可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，(4)。

(6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。

(7)4℃以12000g离心5min。

(8)小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。

(9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。

(10)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶)，振荡，贮存于-20℃。

(二)质粒DNA的大量制备

(1)同上1.(1)

(2)将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。

(3)加氯霉素(170μg/ml)扩增，37℃温箱中培养过夜。

(4)收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。

(5)加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。

(6)加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。

(7)加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。

(8)取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。

(9)15000rpm 4℃ 离心20min。

(10)弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干(10～15min)。

(11)用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。

(12)加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。

(13)分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。

(14)加等体积氯仿/异戊醇(24：1)混匀，同样离心收集上清。

(15)加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。

(16)10000rpm 4℃离心20min。

(17)弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

(18)离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。

(三)质粒DNA的鉴定

1.酶切反应

(1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。

(2)取反应物点样，观察酶切效果。

(3)酶切完全后，70℃5min终止反应。

2.琼脂糖电泳

(1)配制所需浓度琼脂糖凝胶。

(2)在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。

(3)打开电源开关，5V/cm电泳。

(4)在UV灯下观察电泳结果。

二、DNA的重组

(一)DNA的酶切与连接

(1)酶切反应

同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。

(2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。

(3)15000rpm离心15min，弃上清。

(4)加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。

(5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。

(6)测定DNA的含量。

(7)加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。

(8)连接反应液可置-20℃保存，供转化用。

(9)关于待插入DNA片段的获得参见附注。

(二)大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

1.感受态的制备

(1)接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。

(2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。

(3)倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2.重组DNA的转化

(1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：

转化项目	受体菌	DNA	总体积
DNA对照组	0	10μl	200μl
受体菌对照组	200μl	0	200μl
转化组	190μl	10μl	200μl

(2)冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。

(3)42℃90s。

(4)37℃水浴5min。

(5)加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。

(6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

(三)转化子DNA的快速鉴定-快速细胞破碎法

(1)挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。

(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。

(3)加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。

(4)15000rpm离心15min。

(5)吸取上清点样电泳，观察。

(四)转化子DNA的酶切鉴定

1.转化子DNA的快速少量抽提

(1)同本节　二.(三).1.

(2)菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。

(3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。

(4)15000rpm离心15min。

(5)吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。

(6)15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

(7)离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。

(8)取少量DNA电泳，观察浓度。

2.转化子DNA的小量酶切鉴定　　同质粒DNA的小量酶切鉴定，见本节　一(三)。

(五)重组子DNA的进一步鉴定

可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节　四。

[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段

(1)用合适的酶切割DNA并电泳。

(2)于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。

(3)将透析袋(纵长)与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

(4)取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。

(5)吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。

(6)加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。

(7)于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。

(8)用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

(9)真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。