血液样本中提取外泌体

差速超速离心法主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。起始离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。

选取所需沉淀或者上清液样本改用较高的离心速度和超速离心样本，将较小样本颗粒沉降，以此类推，达到分离不同密度、大小颗粒样本的目的。

分离富集得到相对较纯的外泌体颗粒

试剂：细胞培养上清液、DPBS

器材：EP管、移液枪、超速离心管、超速离心机

(1) 将实验样本放入水（室温）中融化，记录原始样本体积与样品编号，于超净台中取实验样本 2 mL 均分加入到 10 mL 的离心管后用 PBS 重悬至 10 mL ，配平后 300 g，使用低速离心机，4 ℃ 离心 10 min，取上清液转移至新的 10 mL 离心管中；

(2) 将收集的上清液配平后 2000 g，4 ℃ 离心 10 min，取上清液转移至超速离心机配套的离心管（10 mL）中；

(3) 配平所收集的超速离心机配套离心管中的上清液后 12000 g，4 ℃ 离心 30 min，取上清液转移至超速离心机配套的离心管（10 mL）中；

(4) 将液体倒入小超离管中，配平所收集的超速离心机配套离心管中的液体后使用水平转子 12000 g，4 ℃ 离心 70 min，拆去离心盖，倒掉液体，将离心管倒置，防止液体回流，取透明沉淀（沉淀在底部），并用 100 μL 的 PBS 对小超离管底部重悬；所得即为外泌体溶液。

(5) 按实验检测的要求分装后 -80 ℃ 冰箱保存。

1. 注意标记沉淀大致位置，避免下机后，遗失位置信息，洗脱不充分或者为洗脱到外泌体。

2. 注意全程无菌操作，避免污染，影响后续实验

3. 高速离心前，一定注意离心管整体的配平（质量平），以避免发生安全事故或者导致严重的机器损毁

4. 收集的新鲜样本，若不及时分离，建议离心至 2000 g，去除细胞碎片等等后，移至 -80 ℃ 保存，避免后续组学分析时发生核糖体污染等情况的发生。

附：血浆样本的制备

1. 静脉采血（尽量用大针头，减少对血液细胞的破坏，污染外泌体），废弃最初的 1~2 mL 血液；

2. 用柠檬酸盐抗凝管收集血液；建议用医用EDTA抗凝管收集，并轻柔充分混匀（30 min 内做后续处理样本）；

3. 800 g 离心 10 min，去除红细胞和白细胞；

4. 收集血清，2500 g 离心 10 min，充分去除血浆中的杂质和细胞碎片等（建议取血浆）；

5. 收集血清（主要含血浆和血小板），-80 ℃ 保存；

6. 干冰运输。

(1) 未见明显沉淀物：

1. 血清或血浆样本可能存在沉淀很少的情况，几乎不可见，所以对于重点标记处一定仔细洗脱。

2. 样本收集以及前处理可能不规范，导致溶血、或者实际收集的样本量少等等。

(2) 重悬后有可见杂质：

一些离心管盖可能经过重复的使用会存在镀层脱落沉淀，可选择瞬离取上清或者过滤等方式去除（可能会造成部分颗粒损失）。