外泌体鉴定之 NTA：纳米颗粒跟踪分析技术

外泌体是直径约为 30~200 nm，密度在 1.13~1.21 g/mL 的小囊泡。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体 （也称为多囊泡体 ）的膜性囊泡。

而 NTA（Nanoparticle Tracking Analysis）技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。

其原理是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合 Stockes-Einstein 方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。相较于其他表征方式，NTA 技术的样本处理更简单、更能保证。

表征外泌体颗粒的浓度以及粒径分布。

材料：

① 外泌体

② DPBS（1x）

设备耗材：

① 1.5 ml、5 ml EP 管

② 大、中枪头

③ 移液枪

④ 涡旋振荡器

⑤ 掌上离心机

⑥ 超净工作台

⑦ NS 300 粒度分析仪

1. 打开仪器电源、电脑软件，确认左下方状态框内连接正常。

2. 将样品池洁净并安装至激光模块上，连接至电源底座上。

3. 开软件， 点击 Start Camera，选择合适的 Screen Gain 和 Camera Level，使用 DPBS 清洗管路使摄像画面上尽量没有颗粒显示。

4. 将提取的外泌体样本从 -80 ℃ 冰箱中取出后置放于冰盒中，融化后稍离心。从中先取 20 ul 加入到新的 1.5 ml EP 管中，再加入 980 ul DPBS 稀释 50 倍尝试，用 1 ML 注射器将稀释后的溶液上样并观察屏幕中颗粒画面，调整焦距。（如检测画面颗粒数较多时需要进行稀释检测，较少时再减少稀释倍数，一般低于 50 倍稀释仍检测效果较差，可能浓度过低）。

5. 在 SOP 中选择所需要的测量方式，调整各项测量参数（如：测量次数、测量时间、稀释倍数等等）。

6. 点击 Creat and Run，依照屏幕提示完成测试。

7. 冲洗样品池，清洗管路。

8. 清洗完毕可以继续后续样本检测，或者关闭仪器及电脑电源。

9. 果分析及数据处理

9-1. 每个样本每检测一次，将得到 4 个主要文件，主要包括：「.avi」（记录颗粒的布朗运动状态）「.pdf」（机器检测报告 PDF 文档）「.csv」（记录检测过程中仪器的温度等参数，以及原始数据） 「.nano」（原始文件，可用 NanoSight NTA 3.4 软件打开）。

9-2. 每个样本将连续采集 3 次测试结果，会有3组数据。

9-3. 如需重新绘制粒径与浓度分布图，可在「.csv」文件中，选择 Bin centre （nm）、Concentration （particles / ml）列数据，利用 Origin、Graph Pad 等软件作图，所得图像与报告基本一致。

注：稀释倍数需根据最后结果得出的颗粒数而定（颗粒数在 20~100 之间即可）

报告提示结果不可信或噪音污染： 

1. 软件分析时，调整合适阈值（一般每帧图片不超过3个蓝色标记的颗粒），降低噪音污染。

2. 颗粒浓度过低，无法测量到准确数值。

3. 整合适的稀释倍数，如画面中颗粒过多可能导致浓度不准、或有散射光较强的颗粒过多可能会造成明显的噪音污染影响结果 。