蛋白复性（三）-蛋白质的结构转换

摘要 　许多不相关的蛋白质含有相同的短肽序列却形成不同的空间构象. 结构转换广泛存在于蛋白质折叠和功能过程中, 具有重要的生物学意义. 综述了Serpin和EF-Tu的失活、血细胞凝集素的激活、蛋白酶成熟、亚基装配和蛋白质淀粉样化等过程中肽链同源肽段的结构转换模式, 并讨论了它在理解蛋白质折叠机理和“构象病”病因中的应用.

关键词 　蛋白质折叠, 结构转换, α/β转换, 淀粉样化

　　蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础, 蛋白质折叠则是形成空间结构的过程. 早在70年代, Anfinsen［1］就提出了蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.
　　蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制. 这不仅是蛋白质拓扑学因素的需要, 而且也是某些蛋白质生理功能调节所必需的. 近年来, 由于某些蛋白质结构转换和错误折叠所引起的“构象病”的发现, 成了刺激蛋白质构象转换与生物功能关系研究热潮的一个重要原因. 这里的结构转换(structural transformation or structural switch)与通常意义的结构变化(structural change)或构象变化(conformational change)不同. 前者指较大程度的结构变化, 往往导致三级结构和二级结构的转变; 后者则仅仅为蛋白质空间结构的扰动或柔性. 本文将从几个方面简述蛋白质结构转换的研究背景和发展前沿.

1　同源肽段的结构转换

　　许多实验表明, 蛋白质多肽片段(fragment)在水溶液中具有与原同源肽段(segment)不一定相同的二级结构［2］; 同一片段在不同的溶剂环境中能进行二级结构的构象转变［3］; 甚至同一肽段在不同的蛋白质中的二级结构也不一样［4］. 天花粉蛋白的α螺旋同源片段在水溶液中则形成β折叠结构, 可在六氟异丙醇中则转变为典型的α螺旋结构［5,6］.Minor和Kim［7］曾设计一个称为“变色龙”肽段(chameleon), 分别插入蛋白质G的IgG结合结构域的不同二级结构区域中, 结果此肽段形成两种不同类型的二级结构. 插入原α螺旋区域的肽段形成α螺旋结构, 而插入原β折叠区域的同样肽段则形成β折叠结构. 同样地, Gasset等［8］发现与传染粒子蛋白(prion)的α螺旋同源多肽片段形成β折叠结构的现象. 另一有趣的研究进展是有关蛋白质炼丹术(protein alchemy)问题, Dalal等［9］通过分子设计置换一半以下的氨基酸残基, 可将一个β折叠为主的蛋白质成功地转换成为全α螺旋折叠类型的蛋白质. 蛋白质中肽链序列虽然有一定的构象形成势, 但不是绝对的. 有时随着环境因素的变化而进行结构的转换. 很可能这是蛋白质为了适应生物功能调节和进化的要求所必需的生理转化.

2　二级结构的转换

　　丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族是研究蛋白质结构转换的典型范例. 体内新合成的或体外再折叠复性的纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor)具有蛋白酶抑制剂的活力(active-form, A型), A型抑制剂的活性部位是一段Loop区域, 此结构可直接插入靶蛋白酶的活性中心形成复合物从而抑制蛋白酶的活性. 有意思的是A型抑制剂能够慢慢转化成无活性的潜伏型(latent-form, L型)抑制剂, 其Loop区肽链转换为β折叠链加入抑制剂蛋白的β折叠片层中. 因此, 抑制剂活性部位有关的残基被包埋导致活力丧失［10］. 另一些抑制剂, 如α1-antitrypsin, 其Loop区先被蛋白酶解再向β折叠链的构象转变成无活力的裂解型(cleaved-form, C型)［11］. L型抑制剂可以通过变性和复性方法转变成A型, 然后又慢慢变成L型. 流感病毒血细胞凝集素(influenza hemagglutinin, HA)在pH诱导下的结构变化与细胞膜融合功能紧密相关的. HA在pH 7.0时, 其空间结构是由helix-loop-helix的头状单体结构域组成的三聚体蛋白(HA-N); 可在低pH(pH＜5)条件下, 中间Loop区域转化为螺旋结构并与另两段螺旋连接共同形成一股长螺旋, 三条长螺旋再绕成三股螺旋束, 称为成融态(fusogenic state, HA-L)［12］. HA-L可介导病毒和宿主细胞的膜融合. 另一例子是蛋白质生物合成过程中的延长因子EF-Tu, 其中的开关区域(switch region)的六个残基肽链ProGluGluLysAlaArg也存在α和β的构象转换［13］. 当EF-Tu与GTP结合成为有活性的GTP型时, 这六肽序列形成α螺旋结构; 而它与GDP结合时形成无活性的GDP型, 此序列则转换为β折叠结构. 从上述例子可以看出, 这种Loop/α、Loop/β或α/β间的二级结构转换构成蛋白质活性调节的开关.

3　前体肽辅助蛋白质折叠

　　一些蛋白酶, 如subtilisin, α-lytic protease和papain等, 新合成的蛋白质产物含有一段前体肽. 前体蛋白能够自发地折叠成正确的三维空间结构. 然后通过蛋白酶的自身酶解切除前体肽, 得到有蛋白酶水解活性的成熟蛋白酶. 虽然成熟蛋白是相当稳定的, 但若通过体外变性, 却不能重新折叠成有生物活性的功能蛋白. 可是, 如果在复性过程中加入前体肽, 则又能再折叠成有活性的蛋白酶分子［14］. 显然, 前体肽对于成熟蛋白的再折叠和复性是至关重要的. 一个有趣的问题是生物为什么选择蛋白酶前体, 仅仅是为了保证成熟蛋白的正确折叠? 一种解释是生物体存在着自身调节的因素. 为了协调蛋白质合成和蛋白质降解的矛盾, 选择失去再折叠能力的成熟蛋白酶, 以保证生物体对于蛋白酶活力的控制. 前面提到的Serpin抑制剂的A型和L型或C型的相互转化可能也是这种适应活性调节的类型.

4　萤光素酶的亚基转换

　　大肠杆菌萤光素酶(luciferase)是由α和β两亚基组成的异二聚体蛋白(αβ). 当β亚基单独存在时能形成非常稳定的同二聚体(β2). 如果在β2二聚体和α亚基同时存在时, 它们不能重组成有活性的αβ异二聚体. 可是, 在β亚基的再折叠过程中加入α亚基, 则能形成有活性的αβ异二聚体［15］. 此实验说明, 在热力学能量上β2比αβ稳定, 而形成αβ的速率大于β2, 有活性的αβ异二聚体的形成是由动力学因素控制的. 究竟这种四级结构的相互转变的生物学意义还不清楚.

5　蛋白质淀粉样化

　　已有很多事实证明, 基因工程产物包涵体的形成和蛋白质淀粉样化(amyloidosis)所引起的疾病都与蛋白质积聚有关［16］. 蛋白质积聚往往由蛋白质的错误折叠所引起的, 而蛋白质构象元件的结构转换是导致蛋白质错误折叠的主要原因. 典型的例子是与疯牛症病因直接相关的prion蛋白的积聚. 正常细胞中PrPc的一段序列是α螺旋结构［17］, 若此α螺旋发生结构转换成β折叠, 则变成为积聚型的PrPsc, PrPsc蛋白引起病状并有传染性［18］. 如果在PrPsc蛋白中加入六氟异丙醇, 则β折叠重新转化为α螺旋, 同时积聚溶解并丧失传染性［19］. 溶菌酶的氨基酸残基突变与人类某些淀粉样化疾病有关. Asp67His突变体的热稳定性下降且易形成纤维状积聚体, 其中α螺旋结构明显减少, 整个积聚体主要由β折叠结构所构成［20］. 另外, βAPP蛋白(β amyloid precursor protein)的剪切和结构转换为β淀粉样肽(β amyloid), 并以多肽链间的β折叠形成纤维状沉积物［21］. 这种由于结构转换引起的淀粉样蛋白沉积与老年痴呆症的发生有关. 其他容易形成淀粉样化并引起疾病的蛋白质还有transthyretin, crystallin等［16,,22,23］. 很显然, 蛋白质的淀粉样化是许多“构象病”的直接原因.

6　问题和展望

　　一般来说, 蛋白质的一级结构决定高级结构, 给定的一级序列就能自发地折叠成特定空间结构和生物功能的蛋白质分子. 这已有大量实验事实证明. 然而, 上述几个例子表明并不是所有蛋白质的天然活性状态一定是热力学上的最稳定态; 动力学因素对折叠途径和亚稳态的形成有一定程度的影响［24］. 在某些特别蛋白质(如上所述)的折叠和功能过程中, 动力学因素的作用相当重要. 假如某个蛋白质折叠成天然态的活化能较大, 折叠反应受动力学因素控制, 先达到结构亚稳态; 接着才受热力学因素的影响, 蛋白质慢慢转化为能量最低状态.
　　从上述例子中看, 具有β折叠结构的蛋白质容易形成积聚, 而纤维状的蛋白质积聚体中往往含有大量的β结构存在. 蛋白质由于突变或其他因素引起α螺旋向β折叠的转换或许是比较普遍的结构转换模式, 具有较广泛的生物学意义. 这方面还有许多例子有待进一步发现. 考察α螺旋和β折叠的结构特征, 发现β折叠往往含较多的非极性残基, 并埋在蛋白质内部形成疏水核心; 而α螺旋通常是两性的, 亲水面位于表面, 疏水一侧朝向蛋白质内部. α/β的结构转换导致疏水核的暴露和亲水面的减少, 容易引起蛋白质分子间形成交叉β折叠结构(cross-β-sheet)这可能是引起prion等蛋白质分子间积聚的主要原因. 那么, 从热力学或动力学观点看, 究竟是什么内在因素引起这种α螺旋向β折叠的转换. 这或许是今后认识蛋白质结构转换和分子积聚本质的基础.
　　总之, 蛋白质的结构转换与蛋白质功能和蛋白质积聚问题已开始受到人们的关注. 对下列几个疑难问题的认识, 将会对生命科学的发展产生重大影响.a.蛋白质折叠是受热力学还是动力学控制;b.结构转换的生物学意义;c.α/β转换有多大的普遍性, 其诱发因素是什么;d.蛋白质在什么条件下会形成积聚(淀粉样化), 它与人类疾病的关系;e.为什么prion蛋白有传染性, 它跟DNA遗传和传染有无关系.f.基因变异所产生的疾病有多少是与蛋白质折叠有关.

参考文献

　[1]　Anfinsen C B. Principles that govern the folding of the protein chains. Science, 1973, 181(4096): 223～227
　[2]　胡红雨, 鲁子贤(Hu H Y, Lu Z X). 二级结构形成: 蛋白质折叠起始的框架模型. 生物化学与生物物理进展(Prog Biochem Biophys), 1994, 21(6): 508～512
　[3]　Searle M S, Williams D H, Packman L C. A short linear peptide derived from the N-terminal sequence of ubiquitin folds into a water-stable non-native β-hairpin. Nat Struct Biol, 1995, 2(11): 999～1006
　[4]　Wilson I A, Haft D H, Getzoff E D, et al. Identical short peptide sequence in unrelated protein can have different conformations. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82(16): 5255～5259
　[5]　Hu H Y, Lu Z X, Du Y C. Solution conformation of T18 peptide derived from Trichosanthin by NMR studies and comparison of T14, TDK and T18 peptides. Chin J Biochem Biophys, 1996, 28(4): 231～239
　[6]　Hu H Y, Lu Z X, Du Y C. Solution conformation of N-terminal fragments of Trichosanthin small domain (TCS182-200): circular dichroic studies. J Pept Res, 1997, 49(2): 113～119
　[7]　Minor D L, Kim P S. Context-dependent secondary structure formation of a designed protein sequence. Nature, 1996, 380(6576): 730～734
　[8]　Gasset M, Baldwin M A, Prusiner S B, et al. Predicted α-helical regions of the prion protein when synthesized as peptides form amyloid. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(22): 10940～10944
　[9]　Dalal S, Balasubramanian S, Regan L. Protein alchemy: changing β-sheet into α-helix. Natl Struct Biol, 1997, 4(7): 548～552
　[10]　Wang Z L, Mottonen J, Goldsmith E J. Kinetically controlled folding of the serpin plasminogen activator inhibitor 1. Biochemistry, 1996, 35(51): 16443～16448
　[11]　Lee K N, Park S D, Yu M H. Probing the native strain in α1-antitrypsin. Nat Struct Biol, 1996, 3(6): 497～500
　[12]　Carr C M, Kims P S. A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin. Cell, 1993, 73(4): 823～832
　[13]　Abel K, Yoder M D, Hilgenfeld R, et al. An α to β conformational switch in EF-Tu. Structure, 1996, 4(10): 1153～1159
　[14]　Gallagher T, Gilliland G, Wang L, et al. The prosegment-subtilisin BPNcomplex: crystal structure of a specific ‘Foldase’. Structure, 1995, 3(9): 907～914
　[15]　Baldwin T O, Christopher J A, Raushel F M, et al. Structure of bacterial luciferase. Curr Opin Struct Biol, 1995, 5(6): 798～809
　[16]　Kelly J W. Alternative conformations of amyloidogenic proteins govern their behavior. Curr Opin Struct Biol, 1996, 6(1): 11～17
　[17]　Riek R, Hornemann S, Wuthrich K, et al. NMR structure of the mouse prion protein domain PrP (121～231). Nature, 1996, 382(6587): 180～182
　[18]　Harrison P M, Bamborough P, Daggett V D, et al. The prion folding problem. Curr Opin Struct Biol, 1997, 7(1): 53～59
　[19]　Safar J, Roller P P, Gajdusek D C, et al. Thermal stability and conformational transitions of scrapie amyloid (prion) protein correlate with infectivity. Protein Sci, 1993, 2(12): 2206～2216
　[20]　Brooth D R, Sunde M, Bellotti V, et al. Instability, unfolding and aggregation of human lysozyme variants underlying amyloid fibrillogenesis. Nature, 1997, 385(6619): 787～793
　[21]　Lansbury P T, Costa P R, Grifiths J M, et al. Structural model for the β-amyloid fibril based on interstrand alignment of an antiparallel-sheet comprising a C-terminal peptide. Nat Struct Biol, 1995, 2(11): 990～998
　[22]　Thomas P J, Qu B H, Pedersen P L. Defective protein folding as a basis of human disease. Trends in Biochem Sci, 1995, 20(11): 457～459
　[23]　Taubes G. Misfolding the way to disease. Science, 1996, 271(5255): 1493～1495
　[24]　Baker D, Agard D. Kinetics versus thermodynamics in protein folding. Biochemistry, 1994, 33(24): 7505～7509

本文原刊登在《生物化学与生物物理进展》1999年第1期