重组DNA的转化实验

实验目的

制备出感受态细胞，把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。

实验原理

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。pUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal培养基生长时，会产生白色的克隆，不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。

实验操作

（一）受体菌的培养与CaCl2 处理（无菌操作）

1、取0.3ml种子液接到装有30 ml LB液体培养基的三用瓶中，振荡培养2-2.5小时

2、取出一定量菌液置于冰浴10分钟

3、4，000rpm，4℃离心5分钟，收集菌体

4、把菌体悬浮在4 ml 100mM冷CaCl2 中，冰浴25分钟。

5、5，000rpm，4℃离心5分钟，收集菌体

6、再把菌体悬浮在1ml 100 mM冷CaCl2 中置4 ℃ 12-24小时，备用。

（二）倒皿铺平板

1、按照各组转化反应的混合物

控制不同的选择性培养基（20 ml/皿）

LB固体培养基（100 ml）Amp（60μg/ml）Tet（40μg/ml）供连接混合物转化，pUC18转化用，共5皿

LB固体培养基（100 ml）Amp （60μg/ml）X-gal （40μg/ml）IPTG（24μg/ml），供连接混合物转化，pUC18转化用，共5皿

2、转化反应前一天，先铺好平板

3、取各组反应物在平板上涂布

4、培养皿倒置于37℃培养箱中过夜

5、观察转化子出现的情况

（三）转化反应

待转化DNA的准备

我们需将连接混合物，提取的pUC18两种样品作转化反应，按下表准备

取上述两组混合物在Eppendorf管中，按如下处理：

1、将各组Eppendorf管置冰浴/小时以上

2、把上述样品置42℃水浴中，2分钟

3、转移到37℃水浴中5分钟，加800μl LB液体培养基

4、在37℃摇床上振荡培养1小时，取25μl涂皿