细菌转化实验

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一．实验目的

1．以pGLO质粒 转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。

2．验证DNA是遗传物质 ，加深对中心法则的理解。

二．实验原理

转化（transformation）是指一段同源或异源的DNA转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程 不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。本实验是用pGLO细菌转化试剂盒中提供的pGLO质粒来转化大肠杆菌，所用方法为CaCl2转化法。<wrapblock><shapetype><br /> pGLO<u>质粒</u> ： <br /> pGLO质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光<u>蛋白表达</u> 的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。 </shapetype> </wrapblock>

<wrapblock><shapetype>三．实验材料<br /> 受体菌：E.coli K12 HB101<br /> 质粒：pGLO plasmid<br /> 转化液（CaCl2）<br /> 氨苄青霉素（amp）<br /> 阿拉伯糖（ara）<br /> 培养基：固体LB、液体LB<br /> 接种环、移液器等<br /> <br /> 四．实验步骤<br /> <br /> 1. 准备平板： 每组：1块LB平板，2块LB/amp平板，1块LB/amp/ara平板<br /> <br /> 2. 准备感受态细胞：用250µl无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受态细胞。<br /> <br /> 3. 活化受体细胞：挑取1环E.coli K12 HB101菌液，于LB培养基上37℃活化16-24h。 　<br /> <br /> 4. 转化：<br /> <stroke> <formulas><f> <f> <f> <f> <f> <f> <f> <f> <f> <f> <f> <f> </f></f></f></f></f></f></f></f></f></f></f></f></formulas> <path> <lock> </lock></path></stroke></shapetype> <shape><imagedata> <wrap> </wrap></imagedata></shape><br /> 1）在两只无菌离心管上分别标<br /> 记+DNA, -DNA。<br /> <br /> 2）在上述两管中分别加入<br /> 250µl转化液。<br /> <br /> 3) 迅速置于冰上。<br /> <br /> 4）各挑取活化好的受体菌的一<br /> 个单菌落，悬浮于两管转化液中。<br /> <br /> 5）在标有+DNA的管中加入一<br /> 环质粒DNA，而标有-DNA的管中不加。<br /> <br /> 6）将上述两管于冰上放置10min。 </wrapblock>

<wrapblock>7）在准备好的培养基底部如左图。<br /> </wrapblock> <wrapblock> </wrapblock>