脱氧核酶实验是什么实验？

脱氧核酶实验是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，进行未知识别的实验方法。在恶性肿瘤的研究方面有巨大前景

脱氧核酶实验是一种用于检测酶的活性的实验。在这个实验中，使用脱氧核酸（DNA）作为底物，通过观察酶对DNA分子的切割能力来测量酶的活性。

通常，在脱氧核酶实验中，将DNA分子置于不同条件下（如不同pH、温度等），并添加酶，然后在一定时间后检测DNA的切割情况。可以使用凝胶电泳等技术来可视化DNA分子的切割情况。

脱氧核酶实验通常用于研究DNA切割酶、限制性酶等酶的活性、特性和功能，也被广泛用于分子生物学、遗传学和生物技术等领域。

脱氧核酶实验是许多具有不同催化功能的 DNA 分子，这些被称为脱氧核酶的催化型 DNA 分子可以催化切割反应、连接反应、卟啉环金属化等许多化学反应，而且还具有 DNA 激酶活性。

实验步骤操作方法

1. “10-23” 型脱氧核酶的设计

(1) 采用 RNA 二级结构分析软件对靶 RNA 进行二级结构模拟分析，选择主环、单链凸出区作为首选切割位点。虽然目前使用的二级结构预测软件的准确性还有待于提高，但是其预测结果仍可以作为选择靶位点和设计脱氧核酶的参考。

(2) 选择切割反应发生在 RNA 分子的嘌呤（G 或 A ) 与嘧啶 ( U 或C ) 之间，一般多将起始密码子 AUG 作为首选候选切割点之一。

(3) 对于长链 RNA 底物，既要考虑脱氧核酶臂的长度，又要考虑脱氧核酶底物结合的稳定性。通常脱氧核酶的臂长为 7~9 个核苷酸，臂过短时核酶与底物结合不稳定，不利于核酶与底物的结合；臂过长时则结合过于牢固，不利于核酶与切割产物的分离，同样影响酶效率。当然，在考虑核臂长的同时，还要考虑核酶的碱基组成。

(4) 应用在细胞内部的脱氧核酶，可以对其臂两端的几个核苷酸进行硫代修饰或甲氧基修饰以提高脱氧核酶在细胞内的稳定性。

(5) 一般需要设计 3~8 条候选脱氧核酶进行实验筛选。

(6) 目前发展了一些筛选可接近位点的方法，也可以针对获得的 RNA 可接近位点设计脱氧核酶以提高设计的准确性。

2. “10-23” 型脱氧核酶体外切割活性的验证

(1) 脱氧核酶切割底物 RNA 反应体系。取 0.5 nmol/L~0.5 μmol/L 脱氧核酶和 0.2 μmol/L 底物分别加入等体积的 2X 脱氧核切割缓冲液，于 37℃ 温育 10 min 后再将两者混合，于 37℃ 温育 1 h。

(2) 加入终止缓冲液结束反应，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析脱氧核酶的切割活性。

(3) 银染或放射自显影。

3. “10-23” 型脱氧核酶体内抑制靶 RNA 基因表达活性的验证

(1) 转染细胞。将无菌的脱氧核酶直接加入细胞培养瓶中，浓度一般为 2~20 μmol/L；如果使用脂质体转染细胞，脱氧核酶的浓度可以降至 0.1~1 μmol/L。设置阴性对照。

(2) 培养 48~72 h 后收集细胞。

(3) 提取 RNA，然后采用 RT-PCR 或 Northern blot 方法检测靶 RNA 的抑制情况。

(4) 裂解细胞，提取蛋白质，采用 Western blot 方法检测靶 mRMA 表达的蛋白质水平的变化。