RNA 提取

获得高质量和完整的 RNA 是很多分子生物学实验中最重要的一步，当前应用最多的是 Trizol/氯仿萃取的方法。

Trizol 是一种单相溶液，由苯酚和异硫氰酸胍等组成。通过加入 Trizol，能破坏细胞和溶解细胞成分，利用氯仿的萃取得到上层水相（含 RNA）、界面层和下层的红色有机相（含 DNA 和蛋白）。得到的水层用异丙醇沉淀并经过酒精的洗涤去除杂质，能分离大小不一的各种 RNA。

RT-PCR、分子克隆、Northern-Blot、RNA 体外转录与翻译等。

试剂：

细胞、Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、75％ 乙醇（使用 RNase-Free 水配制）、RNase-Free 水

器材：

1.5 mL EP管（RNA-free）

大、中、小号枪头（RNA-free）、

移液器

涡旋振荡器

高速冷冻离心机

超净工作台

1. ４ ℃ 预冷离心机。

2. 取出培养皿，在超净台中去除培养基，按照每 1x10⁷ 细胞加入 １mL Trizol 试剂，用枪头吹打充分裂解细胞。

3. 将细胞裂解液转移到 1.5 mL 无 RNA 酶的 EP 管中，向每个 EP 管中加入（1/5 Trizol 体积的）200 μL 氯仿，上下翻转充分混合后，室温静置 10 分钟，使核酸蛋白复合物完全解离。

4. 在 4 ℃ 下 12000 g 离心 15 分钟。

5. 离心后，将上层水相（约 1/2 Trizol 体积）小心转移到一个新的 EP 管，加入等体积异丙醇，震荡后室温静置 5~10 分钟，然后 12000 g 4 ℃ 离心 15 分钟，弃上清保留沉淀。

6. 加入 1 mL 75％ 乙醇清洗并沉淀 RNA，12000 g 离心 10 分钟。

7. 弃上清，并重复上述操作一次。

8. 弃上清，在超净工作台中打开 ep 管盖，风干 5~10 分钟，不需完全干燥。

9. 视沉淀的量，加入 10~30 μL RNase-Free 的 DEPC 双蒸水中。

10. 待沉淀溶解后，用 nanodrop 测定其浓度和纯度并作标记，进行下游实验，多余的 RNA 保存于 -80 ℃ 冰箱。

1. 过程中需佩戴口罩和新手套，对台面以及周围环境进行灭酶处理，尽量在超净台中进行操作。

2. 使用无 Rnase 的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

3. 溶液配制应使用无 Rnase 的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度为 0.1%（V/V），放置过夜，高压灭菌。注：DEPC 有致癌之嫌，须小心操作）。

4. Trizol 裂解液非常危险，因小心避免溅到身上，台面上的 Trizol 要及时清理干净。

RNA 得率过低：

1. 使用更有效的破碎/匀浆方法，如液氮捣碎、酶消化破壁、电动匀浆器匀浆；

2. 更换抽提试剂；

3. 核酸浓度低时，采用低温沉淀，并延长沉淀时间；

4.增加细胞。

RNA质量不高：

1. 取上层水相时求多，吸到了下层有机相；

2. 清洗不干净。