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RNA 提取

相关实验:RNA提取及检测

最新修订时间:

简介

获得高质量和完整的 RNA 是很多分子生物学实验中最重要的一步,当前应用最多的是 Trizol/氯仿萃取的方法。

原理

Trizol 是一种单相溶液,由苯酚和异硫氰酸胍等组成。通过加入 Trizol,能破坏细胞和溶解细胞成分,利用氯仿的萃取得到上层水相(含 RNA)、界面层和下层的红色有机相(含 DNA 和蛋白)。得到的水层用异丙醇沉淀并经过酒精的洗涤去除杂质,能分离大小不一的各种 RNA。

用途

RT-PCR、分子克隆、Northern-Blot、RNA 体外转录与翻译等。

材料与仪器

试剂:

细胞、Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇(使用 RNase-Free 水配制)、RNase-Free 水

器材:

1.5 mL EP管(RNA-free)

大、中、小号枪头(RNA-free)、

移液器

涡旋振荡器

高速冷冻离心机

超净工作台

步骤

1. 4 ℃ 预冷离心机。

2. 取出培养皿,在超净台中去除培养基,按照每 1x107 细胞加入 1mL Trizol 试剂,用枪头吹打充分裂解细胞。

3. 将细胞裂解液转移到 1.5 mL 无 RNA 酶的 EP 管中,向每个 EP 管中加入(1/5 Trizol 体积的)200 μL 氯仿,上下翻转充分混合后,室温静置 10 分钟,使核酸蛋白复合物完全解离。

4. 在 4 ℃ 下 12000 g 离心 15 分钟。

5. 离心后,将上层水相(约 1/2 Trizol 体积)小心转移到一个新的 EP 管,加入等体积异丙醇,震荡后室温静置 5~10 分钟,然后 12000 g 4 ℃ 离心 15 分钟,弃上清保留沉淀。

6. 加入 1 mL 75% 乙醇清洗并沉淀 RNA,12000 g 离心 10 分钟。

7. 弃上清,并重复上述操作一次。

8. 弃上清,在超净工作台中打开 ep 管盖,风干 5~10 分钟,不需完全干燥。

9. 视沉淀的量,加入 10~30 μL RNase-Free 的 DEPC 双蒸水中。

10. 待沉淀溶解后,用 nanodrop 测定其浓度和纯度并作标记,进行下游实验,多余的 RNA 保存于 -80 ℃ 冰箱。

注意事项

1. 过程中需佩戴口罩和新手套,对台面以及周围环境进行灭酶处理,尽量在超净台中进行操作。

2. 使用无 Rnase 的塑料制品和枪头,避免交叉污染。

3. 溶液配制应使用无 Rnase 的水(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入 DEPC 至终浓度为 0.1%(V/V),放置过夜,高压灭菌。注:DEPC 有致癌之嫌,须小心操作)。

4. Trizol 裂解液非常危险,因小心避免溅到身上,台面上的 Trizol 要及时清理干净。

常见问题

RNA 得率过低:

1. 使用更有效的破碎/匀浆方法,如液氮捣碎、酶消化破壁、电动匀浆器匀浆;

2. 更换抽提试剂;

3. 核酸浓度低时,采用低温沉淀,并延长沉淀时间;

4.增加细胞。

RNA质量不高:

1. 取上层水相时求多,吸到了下层有机相;

2. 清洗不干净。

来源:丁香实验

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